Apelin-13通過ABCA1改善APP-PS1小鼠的認(rèn)知與記憶功能.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種發(fā)病率較高、危害性較大的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床特征為進(jìn)行性認(rèn)知和記憶功能減退。β-淀粉樣蛋白（β-Amyloid protein，Aβ）在腦內(nèi)的生成和沉積所形成的老年斑（senile plaque， SP）在AD的病理過程中起重要的作用。Aβ生成增加、酶介導(dǎo)的Aβ降解不足以及Aβ從腦內(nèi)清除減少是導(dǎo)致Aβ聚集的重要原因。過量的Aβ聚集后形成淀粉樣沉積和老年斑，從而產(chǎn)

2、生神經(jīng)毒性，出現(xiàn)認(rèn)知及記憶功能損害。
　　三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）與Aβ代謝聯(lián)系緊密。ABCA1蛋白缺失會導(dǎo)致腦內(nèi)載脂蛋白E（apolipoprotein E， apoE）荷脂減少和Aβ水平增加。ABCA1蛋白過表達(dá)會增加腦內(nèi)apoE荷脂和減少Aβ水平，進(jìn)而對AD產(chǎn)生影響。ABCA1高表達(dá)時，Aβ生成減少，降解和清除增加。鑒于ABCA1在Aβ的

3、代謝和集聚中起非常重要作用，可以將ABCA1作為治療AD的一個重要靶點。因此，尋找一種能有效增加ABCA1表達(dá)的物質(zhì)變得至關(guān)重要。
　　Apelin是脂肪細(xì)胞分泌的一種具有生物活性的肽類激素，在體內(nèi)具有廣泛的組織學(xué)分布。近來研究表明，Apelin在海馬神經(jīng)元保護(hù)過程中起重要的作用?；诤ｑR神經(jīng)元在學(xué)習(xí)與記憶中具有重要的地位，提示apelin對學(xué)習(xí)記憶具有調(diào)節(jié)作用。我們前期研究表明，Apelin-13增加THP-1源性巨噬細(xì)胞ABC

4、A1水平，但其對Aβ代謝的作用目前尚不清楚。鑒于ABCA1蛋白與Aβ代謝之間的密切關(guān)系，我們提出以下假設(shè)：apelin-13通過增加ABCA1蛋白水平減少Aβ沉積及改善AD模型鼠認(rèn)知與記憶功能。
　　本課題分三個部分來驗證假設(shè)，第一部分使用apelin-13處理大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株（PC-12細(xì)胞，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特性），觀察apelin-13是否通過影響ABCA1蛋白水平從而調(diào)節(jié)PC-12細(xì)胞Aβ代謝，并闡明其機(jī)制。第二部分使

5、用apelin-13處理APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察apelin-13是否改善AD模型鼠的認(rèn)知記憶功能及減少其Aβ沉積。第三部分使用ABCA1 SiRNA沉默APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織ABCA1表達(dá)，觀察apelin-13是否通過ABCA1蛋白改善AD模型鼠的認(rèn)知記憶功能及減少其Aβ沉積。本研究對AD的防治提供了一個新的實驗依據(jù)。
　　第一部分,Apelin-13增加PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白水平調(diào)節(jié)Aβ代謝
　　目

6、的：觀察apelin-13是否通過影響ABCA1蛋白水平從而調(diào)節(jié)Aβ代謝，并闡明其機(jī)制。
　　方法：①Western blot檢測PC-12細(xì)胞血管緊張素受體AT1相關(guān)的受體蛋白（putative recep tor p rotein related to the angiotensin recep tor AT1，APJ）表達(dá)，以確定PC-12細(xì)胞存在apelin-13作用受體。②用不同濃度（1、10、100nmol/L）的ap

7、elin-13處理PC-12細(xì)胞24h及用100nmol/L apelin-13處理細(xì)胞24不同時間（12h、24h、48h）后，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測Aβ1-40及Aβ1-42水平，Western blot免疫印跡法檢測APP、BACE1及NEP蛋白水平，根據(jù)試劑盒方法檢測BACE1及NEP酶活性， RT-PCR檢測ABCA1 mRNA水平，Western Blot檢測ABCA1蛋白水平，液體閃爍計數(shù)法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出

8、。③先使用ABCA1 SiRNA抑制PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)，再使用100nmol/L apelin-13處理PC-12細(xì)胞24h，ELISA檢測Aβ1-40及Aβ1-42水平，根據(jù)試劑盒方法檢測BACE1及NEP酶活性。以確定ABCA1在apelin-13對PC-12細(xì)胞Aβ代謝影響中所起的作用。④先使用PKCαSiRNA抑制PKCα表達(dá)，再使用100nmol/L apelin處理PC-12細(xì)胞24h，檢測apelin對ABC

9、A1蛋白水平的影響。使用不同濃度（1、10、100nmol/L）的apelin-13處理PC-12細(xì)胞24h，檢測鈣調(diào)蛋白（calpain）活性。⑤使用不同濃度（1、10、100nmol/L）apelin-13處理PC-12細(xì)胞24h，Western blot方法檢測apoE蛋白表達(dá)水平。使用apoE SiRNA抑制apoE表達(dá)，100nmol/L apelin處理PC-12細(xì)胞24h，檢測apelin對BACE1及NEP酶活性的影響。

10、
　　結(jié)果：①PC-12細(xì)胞存在APJ表達(dá)。②Apelin-13顯著降低PC-12細(xì)胞Aβ1-40 及Aβ1-42水平，對APP、BACE1及NEP蛋白表達(dá)無顯著影響，降低BACE1酶活性，增加NEP酶活性，對ABCA1 mRNA水平無影響，增加ABCA1蛋白水平，促進(jìn)膽固醇流出，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。③使用ABCA1 SiRNA抑制PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)后，apelin-13降低PC-12細(xì)胞Aβ1-40及Aβ

11、1-42水平的作用顯著減弱，其降低 BACE1酶活性及增加 NEP酶活性的作用顯著抑制。④使用 PKCα SiRNA抑制PC-12細(xì)胞PKCα表達(dá)后，apelin增加ABCA1蛋白水平的作用減弱；Apelin-13顯著抑制PC-12細(xì)胞calpain活性。⑤Apelin-13對PC-12細(xì)胞apoE蛋白表達(dá)無顯著影響；使用apoE SiRNA抑制PC-12細(xì)胞apoE表達(dá)后，apelin-13降低BACE1酶活性及增加NEP酶活性的作用

12、顯著減弱。
　　結(jié)論：
　?、貯pelin-13通過PKCα途徑增加PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白水平；
　　②Apelin-13通過增加PC-12細(xì)胞ABCA1蛋白水平，降低BACE1活性減少Aβ生成、增強(qiáng)NEP活性增加Aβ降解，從而減少Aβ水平。
　　第二部分,Apelin-13改善APP/PS1小鼠認(rèn)知與記憶功能
　　目的：觀察apelin-13是否影響APP/PS1小鼠認(rèn)知與記憶功能及腦組織Aβ代謝。

13、
　　方法：用不同劑量（1、2、4μg）的apelin-13側(cè)腦室注射處理APP/PS1小鼠30天（1次/天）后，Y迷宮實驗、新物體識別實驗及Morris水迷宮實驗檢測小鼠認(rèn)知與記憶功能。隨后處死小鼠，ELISA檢測小鼠海馬和前額葉組織的Aβ1-40及Aβ1-42水平，剛果紅染色檢測海馬組織Aβ沉積情況，Western blot檢測海馬和前額葉組織APP、BACE1及NEP蛋白水平，根據(jù)試劑盒方法檢測海馬和前額葉組織BACE1及N

14、EP酶活性，ELISA檢測小鼠外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平，Western blot檢測海馬和前額葉組織ABCA1蛋白水平。
　　結(jié)果：Apelin-13顯著提高APP/PS1小鼠在Y迷宮實驗中的正確率，顯著增加APP/PS1小鼠在新物體識別實驗中（無論是短時檢測還是長時檢測）對新物體的認(rèn)知能力，并且顯著減少APP/PS1小鼠在Morris水迷宮實驗中的平均游泳距離及平均潛伏期。Apelin-13顯著降低 APP/PS1小

15、鼠海馬和前額葉組織的Aβ1-40及 Aβ1-42水平，對APP、BACE1及NEP蛋白水平無顯著影響，減少海馬和前額葉組織BACE1酶活性，增加NEP酶活性，顯著增加外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平，顯著提高海馬和前額葉組織ABCA1蛋白水平。
　　結(jié)論：
　?、貯pelin-13改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知與記憶功能；
　?、贏pelin-13減少APP/PS1小鼠海馬和前額葉組織Aβ生成，增加Aβ降解及清除。<

16、br>　?、跘pelin-13增加APP/PS1小鼠海馬和前額葉組織ABCA1蛋白水平。
　　第三部分 Apelin-13通過ABCA1改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知與記憶能力
　　目的：觀察apelin-13是否通過ABCA1蛋白影響APP/PS1小鼠認(rèn)知與記憶功能及腦組織Aβ代謝。
　　方法：使用ABCA1 SiRNA側(cè)腦室注射沉默APP/PS1小鼠腦組織ABCA1蛋白表達(dá)，觀察apelin-13對AD模型小鼠認(rèn)知與

17、記憶功能及腦組織Aβ代謝的影響。Y迷宮實驗、新物體識別實驗及Morris水迷宮實驗檢測小鼠認(rèn)知與記憶功能。處死小鼠，ELISA檢測小鼠海馬和前額葉組織的Aβ1-40及Aβ1-42水平，剛果紅染色檢測海馬組織Aβ沉積情況，試劑盒檢測海馬和前額葉組織BACE1及NEP酶活性，ELISA檢測小鼠外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平。
　　結(jié)果：當(dāng)腦組織ABCA1表達(dá)被沉默后，Apelin-13對APP/PS1小鼠認(rèn)知記憶功能及腦組織Aβ

18、沉積的改善作用減弱，Apelin-13對APP/PS1小鼠海馬和前額葉組織 BACE1活性的抑制作用及對NEP活性的促進(jìn)作用降低，Apelin-13增加外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平的效應(yīng)下降。
　　結(jié)論：
　?、貯pelin-13通過增加ABCA1蛋白水平改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知與記憶功能；
　?、贏pelin-13通過增加ABCA1蛋白水平減少APP/PS1小鼠海馬和前額葉組織Aβ生成，增加Aβ降解及清除