沙門菌invA基因的克隆、表達與表達產物的初步研究.pdf

1、目的： 通過擴增沙門菌invA基因，構建pET-invA重組子，實現(xiàn)沙門菌invA基因在大腸桿菌中的高效表達，表達產物經金屬離子親和層析純化后，免疫CDl小鼠和新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體，并對免疫血清的性質進行初步研究，為后續(xù)研究該蛋白的特性和應用奠定基礎。 方法： 本研究分為三部分： 1．沙門菌invA基因原核表達重組質粒的構建：根據invA基因序列設計引物，用PCR方法自沙門菌基因組中擴增invA基

2、因目的片段。將該基因與原核表達質粒載體pET-30c(+)連接，構建重組質粒pET-invA，并轉化克隆宿主菌E.coli DH5a，利用卡那霉素抗性篩選陽性克隆，質粒小量提取后，用雙酶切和基因序列測定鑒定重組質粒。 2．沙門菌InvA融合蛋白的表達、純化及鑒定：第一部分所得重組質粒pET-invA轉化表達宿主菌E.coil BL21(DE3)，IPTG誘導融合蛋白表達，SDS-PAGE分析目的蛋白表達情況；通過鎳金屬離子親和層

3、析對InvA融合蛋白進行純化，SDS-PAGE檢測蛋白純度和分子量，用anti-His-tag單克隆抗體以Western blotting鑒定誘導表達的重組InvA蛋白。 3．InvA融合蛋白的免疫原性研究：使用考馬斯亮蘭法總蛋白定量測試盒對所得到的純化產物進行含量測定后，用來免疫CDl小鼠和新西蘭大白兔，間接ELISA法測定多克隆抗體的效價，并通過玻片凝集試驗觀察所制備的抗體與沙門菌的特異性凝集反應。收集的血清在0.02％NA

4、N<,3>中-70℃保存。 結果： 1．成功構建沙門菌invA基因的原核表達重組質粒pET-invA。此質粒經雙酶切后，得到表達載體片段(5.4kb)和目的基因片段(1.119kb)；經測序，目的基因全長1119bp，與GenBank中所公布的序列相比較，存在9個堿基的差異，同源性大于99％；編碼含372個氨基酸殘基的多肽鏈。 2．經IPTG誘導，含重組質粒pET-invA的表達宿主菌E．coli BL21(DE

5、3)在SDS-PAGE上大約48kD處有明顯的表達條帶，與核酸序列測定所推導的InvA融合蛋白分子量相符。在變性條件下，重組蛋白通過鎳金屬離子親和層析進行純化，得到了電泳純的lava融合蛋白，純化產物能與anti-His-tag單克隆抗體發(fā)生特異性結合，證實為InvA融合蛋白。 3．純化產物經測定，其蛋白濃度達到1mg／ml。用純化產物免疫CDl小鼠及新西蘭大白兔可以得到多克隆免疫血清，經間接ELISA測定，兩種動物源性的抗體效

6、價均大于1：400,000，所制備的抗體經玻片凝集試驗鑒定，可與沙門菌發(fā)生凝集反應。 結論： 本研究成功構建了原核表達重組質粒pET-invA，實現(xiàn)了沙門菌侵襲蛋白A基因在原核細胞中的高效表達，通過變性條件下的鎳金屬離子親和層析，獲得純度較高的InvA融合蛋白，純化的表達產物能刺激CDl小鼠和新西蘭大白兔產生特異性抗體，抗體效價均大于1：400,000，并能與沙門菌發(fā)生凝集，具有良好的免疫原性，為后續(xù)對該蛋白相關性質的研