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文檔簡介
1、目的: 通過擴(kuò)增沙門菌invA基因,構(gòu)建pET-invA重組子,實(shí)現(xiàn)沙門菌invA基因在大腸桿菌中的高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)金屬離子親和層析純化后,免疫CDl小鼠和新西蘭大白兔,獲得多克隆抗體,并對免疫血清的性質(zhì)進(jìn)行初步研究,為后續(xù)研究該蛋白的特性和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法: 本研究分為三部分: 1.沙門菌invA基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建:根據(jù)invA基因序列設(shè)計(jì)引物,用PCR方法自沙門菌基因組中擴(kuò)增invA基
2、因目的片段。將該基因與原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET-30c(+)連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-invA,并轉(zhuǎn)化克隆宿主菌E.coli DH5a,利用卡那霉素抗性篩選陽性克隆,質(zhì)粒小量提取后,用雙酶切和基因序列測定鑒定重組質(zhì)粒。 2.沙門菌InvA融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定:第一部分所得重組質(zhì)粒pET-invA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coil BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況;通過鎳金屬離子親和層
3、析對InvA融合蛋白進(jìn)行純化,SDS-PAGE檢測蛋白純度和分子量,用anti-His-tag單克隆抗體以Western blotting鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的重組InvA蛋白。 3.InvA融合蛋白的免疫原性研究:使用考馬斯亮蘭法總蛋白定量測試盒對所得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行含量測定后,用來免疫CDl小鼠和新西蘭大白兔,間接ELISA法測定多克隆抗體的效價(jià),并通過玻片凝集試驗(yàn)觀察所制備的抗體與沙門菌的特異性凝集反應(yīng)。收集的血清在0.02%NA
4、N<,3>中-70℃保存。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建沙門菌invA基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-invA。此質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,得到表達(dá)載體片段(5.4kb)和目的基因片段(1.119kb);經(jīng)測序,目的基因全長1119bp,與GenBank中所公布的序列相比較,存在9個(gè)堿基的差異,同源性大于99%;編碼含372個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。 2.經(jīng)IPTG誘導(dǎo),含重組質(zhì)粒pET-invA的表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE
5、3)在SDS-PAGE上大約48kD處有明顯的表達(dá)條帶,與核酸序列測定所推導(dǎo)的InvA融合蛋白分子量相符。在變性條件下,重組蛋白通過鎳金屬離子親和層析進(jìn)行純化,得到了電泳純的lava融合蛋白,純化產(chǎn)物能與anti-His-tag單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,證實(shí)為InvA融合蛋白。 3.純化產(chǎn)物經(jīng)測定,其蛋白濃度達(dá)到1mg/ml。用純化產(chǎn)物免疫CDl小鼠及新西蘭大白兔可以得到多克隆免疫血清,經(jīng)間接ELISA測定,兩種動物源性的抗體效
6、價(jià)均大于1:400,000,所制備的抗體經(jīng)玻片凝集試驗(yàn)鑒定,可與沙門菌發(fā)生凝集反應(yīng)。 結(jié)論: 本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-invA,實(shí)現(xiàn)了沙門菌侵襲蛋白A基因在原核細(xì)胞中的高效表達(dá),通過變性條件下的鎳金屬離子親和層析,獲得純度較高的InvA融合蛋白,純化的表達(dá)產(chǎn)物能刺激CDl小鼠和新西蘭大白兔產(chǎn)生特異性抗體,抗體效價(jià)均大于1:400,000,并能與沙門菌發(fā)生凝集,具有良好的免疫原性,為后續(xù)對該蛋白相關(guān)性質(zhì)的研
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