利用代謝工程手段改善乳酸乳球菌脅迫抗性的研究.pdf

1、江南大學(xué)博士學(xué)位論文利用代謝工程手段改善乳酸乳球菌脅迫抗性的研究姓名：傅瑞燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師：陳堅(jiān)20060301江南大學(xué)博士學(xué)位論文利用代謝工程手段改善乳酸乳球菌脅迫抗性的研究的降低。然而，源自丙酮酸的次要代謝產(chǎn)物，如異戊醇、苯乙醇和苯乙胺的產(chǎn)量至少比乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)高10倍。3Ⅲ轡基因的本底表達(dá)可以顯著增加乳酸乳球菌NZ9000對(duì)氧脅迫的抗性。處于對(duì)數(shù)中期的乳酸乳球菌Nz9000(pF

2、L010)經(jīng)H202脅迫(50mm01Lf，80min)和甲萘醌(20H1H10lL‘f，80m曲)脅迫后的存活率分別是乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)的837倍和178^倍。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MTG具有在體外直接清除H202和02一的微弱的抗氧化活性。同時(shí)，MTG的交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物沒有清除H202的作用。4m轡基因的本底表達(dá)能夠增強(qiáng)乳酸乳球菌Nz9000對(duì)酸脅迫的抗性。在pH25的條件下脅迫15mill、30miIl和45miIl后，處

3、于對(duì)數(shù)前期的乳酸乳球菌Nz9000(pFL010)的存活率分別是乳酸乳球菌Nz9000(pNZ8148)的16倍、2_2倍和39倍。但是，處于穩(wěn)定期的乳酸乳球菌Nz9000(pFLOlO)對(duì)酸脅迫的抗性反而比乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)弱。可能的原因是較高的pH。。會(huì)抑制乳酸乳球菌Nz9000自身酸脅迫誘導(dǎo)型的抗酸脅迫機(jī)制的活性。5在高致死率的脅迫條件下，GSH可以增強(qiáng)乳酸乳球菌Nz9000對(duì)H202和甲萘醌所引發(fā)氧脅迫的抗

4、性。經(jīng)50mmoIL。1H202脅迫15min后，處于對(duì)數(shù)中期的具有GsH合成能力的乳酸乳球菌Nz9000(pNz3203)的存活率是乳酸乳球菌Nz9000(pNz8148)的12倍：而經(jīng)l50mmol一H202脅迫15min后，乳酸乳球菌Nz9000(pNz3203)的存活率是乳酸乳球菌Nz9000fpNz8148)的26倍。經(jīng)20mmolL。1甲萘醌脅迫60min后，處于對(duì)數(shù)中期的乳酸乳球菌Nz9000(pNZ3203)存活率是乳酸

5、乳球菌Nz9000(pNz8148)的62倍。6通過構(gòu)建具有GsH合成能力的乳酸乳球菌NZ9000的超氧化物歧化酶(SodA)突變株乳酸乳球菌Nz4504(pNz3203)，發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌NZ9000自身氧脅迫抗性被削弱的條件下，在宿主菌抵抗氧脅迫中，GsH可以表現(xiàn)出更強(qiáng)的保護(hù)作用。GSH可以減輕30umolL。1甲萘醌脅迫給乳酸乳球菌Nz9000的sodA缺失突變株乳酸乳球菌Nz4504帶來的生長(zhǎng)抑制。經(jīng)50mmolL。1H202脅

6、迫45min后，處于對(duì)數(shù)前期的乳酸乳球菌Nz4504(pNz3203)存活率是對(duì)照菌乳酸乳球菌Nz4504(pNZ8148)的108倍。7通過構(gòu)建具有GSH合成能力的乳酸乳球菌SKll(pNZ9530／pNz3203)，發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌SKll中生產(chǎn)GSH可以顯著提高宿主菌的好氧生長(zhǎng)性能和pH。。。乳酸乳球菌SKll(pNZ9530／pNz3203)在M17培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基中好氧生長(zhǎng)的最高生物量(OD600)分別為609士002和64