榮昌豬BPI基因全長(zhǎng)cDNA克隆及SNP分析.pdf

1、殺菌通透性增強(qiáng)蛋白(bactericidal/permeability-increasingprotein，BPI)是人和哺乳動(dòng)物內(nèi)源性陽(yáng)離子蛋白質(zhì)，主要存在于多形核白細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中。它具有很強(qiáng)的殺菌(主要指革蘭氏陰性細(xì)菌)活性、中和內(nèi)毒素或脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)活性和調(diào)理功能，在動(dòng)物機(jī)體天然防御中起到很重要的作用。目前，人、牛、鼠的BPI基因序列都已清楚，但豬BPI基因全長(zhǎng)cDNA序列未知。此外，

2、人BPI基因外顯子3和4區(qū)域存在多態(tài)性，豬BPI基因第4和10外顯子的RFLP多態(tài)性與沙門氏菌的易感性有關(guān)，并被確定為抗病育種的候選基因。而被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為重點(diǎn)保護(hù)豬種的榮昌豬，其BPI基因外顯子3和4區(qū)域的多態(tài)性還有待研究。 本試驗(yàn)擬克隆出榮昌豬BPI基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorp

3、hism，PCR-SSCP)技術(shù)，檢測(cè)其第3和4外顯子的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位點(diǎn)。這些結(jié)果的獲得，不僅可以為豬BPI功能研究、榮昌豬BPI基因多態(tài)性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且對(duì)進(jìn)一步尋找到合適的抗病育種或相關(guān)分子標(biāo)記、分析BPI基因多態(tài)性與榮昌豬抗病力的相關(guān)性和榮昌豬的保種選育等研究具有基礎(chǔ)貢獻(xiàn)意義。 試驗(yàn)的方法及技術(shù)路線： (1)榮昌豬BPI基因全長(zhǎng)cDNA克隆及生

4、物信息學(xué)分析： 首先選取一頭100日齡左右健康的榮昌豬，提取其前腔靜脈血總RNA，然后進(jìn)行RT-PCR得到cDNA第一鏈；再根據(jù)同源性克隆方法，結(jié)合3'-和5'-cDNA末端快速擴(kuò)增(RapidamlificationofcDNAends，RACE)技術(shù)，分別克隆出榮昌豬BPI序列的中間編碼區(qū)序列、3'-非編碼區(qū)序列(untranslatedregion，UTR)和5'-UTR；拼接出全長(zhǎng)cDNA序列，并進(jìn)行序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)功能預(yù)

5、測(cè)等生物信息學(xué)分析鑒定。 (2)榮昌豬BPI基因第3和4外顯子序列SNP位點(diǎn)分析： 隨機(jī)選取120頭健康的榮昌豬，提取其耳組織基因組DNA，再以其為模板擴(kuò)增出第3和4外顯子序列；PCR產(chǎn)物經(jīng)12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)，120V，4℃持續(xù)14h，然后銀染顯帶；統(tǒng)計(jì)不同帶型出現(xiàn)的頻率(即基因型頻率)和等位基因頻率，并將顯示不同帶型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆

6、測(cè)序；最后根據(jù)測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析出外顯子3和4區(qū)段存在的SNP位點(diǎn)，并根據(jù)這些SNP位點(diǎn)在等位基因中的分布和等位基因頻率，計(jì)算出各SNP位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)堿基頻率。 試驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論： (1)本試驗(yàn)首次克隆得到了榮昌豬BPI基因全長(zhǎng)cDNA序列，也是豬BPI基因全長(zhǎng)cDNA序列的首次報(bào)道，其Genebank登錄號(hào)為：EF436278。序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)顯示，榮昌豬BPI同人、牛等物種BPI具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。 (2)本

7、試驗(yàn)應(yīng)用PCR-SSCP分析方法，在榮昌豬BPI基因外顯子3區(qū)段檢測(cè)到一個(gè)新的SNP位點(diǎn)，即第397位的G→A突變，引起氨基酸由Arg替換為Gln，且產(chǎn)生帶正電荷的Arg的堿基G為該位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)堿基，頻率為0.7417。該位點(diǎn)的突變可能對(duì)榮昌豬BPI蛋白功能及機(jī)體天然免疫力有重要影響。外顯子4區(qū)段共檢測(cè)到4個(gè)SNP位點(diǎn)，它們是T512C，G551T，C563T，G599A。其中T512C，G551T，C563T為首次報(bào)道，G551T突變還

8、產(chǎn)生了一個(gè)新的限制性內(nèi)切酶MscI或BalI酶切位點(diǎn)(TGG/CCA)。第512、551、563、599位的優(yōu)勢(shì)堿基分別為C、G、C、G，出現(xiàn)的頻率分別為0.6334，0.725，0.725，0.7501。此外，通過榮昌豬外顯子4序列與豬EST序列比對(duì)分析，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)第479位的T→C突變。榮昌豬BPI基因外顯子4區(qū)段的高度多態(tài)性，表明該區(qū)段有較大的遺傳選擇潛力。 通過分析推斷，本試驗(yàn)檢測(cè)到的外顯子3和4區(qū)段的某些SNP位點(diǎn)，