鄂贛浙3省10地12株并殖吸蟲基因ITS2分析.pdf

1、并殖吸蟲俗稱肺吸蟲，某些寄生于人體的蟲體可引起并殖吸蟲病(肺吸蟲病)。并殖吸蟲在分類上隸屬于生物的真核總界、動物界、扁形動物門、吸蟲綱、復(fù)殖目、并殖科。并殖吸蟲種類命名甚多，存在同種異名和種名錯定等諸多問題。并殖吸蟲在東亞、東南亞、非洲和拉丁美州等國家廣泛存在；中國各地也均有發(fā)現(xiàn)，主要在江南、西南與東北各地。從1879年Ringer首先在我國臺灣發(fā)現(xiàn)人體病例130年以來，世界學(xué)者對并殖吸蟲的特征、獨立地位、地理分布和致病作用等存在分歧。

2、主要以并殖吸蟲成蟲形態(tài)和生活史為依據(jù)的傳統(tǒng)分類存在一定的局限性，如因不同地區(qū)、不同宿主、不同發(fā)育期和標(biāo)本制作時個體差異所導(dǎo)致成蟲的形態(tài)差異。而對于生活史，目前只有少數(shù)蟲種的生活史被完整闡明，有一些蟲種的第一和第二中間宿主尚未被證實。20世紀(jì)60～80年代，由于并殖吸蟲分類研究極度活躍，出現(xiàn)了很多并殖吸蟲新種的描述。20世紀(jì)90年代以來，分子生物學(xué)的發(fā)展為研究物種遺傳變異奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的：采用ITS2基因序列分析技術(shù)對鄂浙

3、贛3省10地12株并殖吸蟲進(jìn)行遺傳變異檢測，以了解基因序列變化差異，為并殖吸蟲分類提供依據(jù)，同時也為湖北省并殖吸蟲流行區(qū)的劃分提供可靠的分子生物學(xué)依據(jù)。
　　 方法：采集鄂贛浙3省10地：湖北省咸寧市溫泉區(qū)桂花鎮(zhèn)茅田、江西武寧縣三爪、浙江紹興蘭亭鄉(xiāng)、湖北省赤壁市趙李橋鎮(zhèn)柘砰村、湖北省十堰市花果、湖北省五峰縣、湖北鶴峰縣五里鎮(zhèn)南村、湖北鶴峰縣走馬鎮(zhèn)大典、湖北隨州和湖北神農(nóng)架林區(qū)等10地共12株并殖吸蟲。其中湖北咸寧株、湖北十堰株、

4、江西武寧株和浙江蘭亭株為成蟲，湖北隨州株為童蟲，其余5地標(biāo)本均為囊蚴。為避免混淆，本文中均以地理株命名。12株并殖吸蟲標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察測量，并提取4地成蟲、1地童蟲和5地囊蚴的基因組DNA。用3s’和BD2兩對引物擴(kuò)增ITS2序列，獲得基因片段交由上海生工公司進(jìn)行基因測序。所得12株并殖吸蟲ITS 2序列經(jīng)Bioedit、Clustalx和MEGA4.0等軟件進(jìn)行遺傳距離分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。
　　 結(jié)果：⑴外形觀察：成蟲

5、湖北十堰株呈長梭形，湖北咸寧株、江西武寧株和浙江蘭亭株等3株呈橢圓形；囊蚴 5地囊蚴呈橢圓形或類圓形，囊壁2層，排泄囊內(nèi)含黑色顆粒，經(jīng)鑒定為并殖吸蟲囊蚴。其中湖北赤壁株內(nèi)壁較厚；五峰a、五峰b、走馬a、走馬b和五里等5株內(nèi)壁較薄；湖北神農(nóng)架株的囊蚴形態(tài)因故已有變形，但可以確定為并殖吸蟲；童蟲 湖北隨州株呈長梭形。⑵DNA提?。篋NA溶液A260/280值經(jīng)測定在1.60～2.00之間，純度符合要求。⑶PCR擴(kuò)增及基因測序，通過MEGA4

6、.0分析基因序列：各株間差異湖北咸寧株、江西武寧株、浙江蘭亭株和湖北赤壁株等4株的遺傳距離在0.01897～0.11278；湖北走馬a、b兩株，湖北五峰a、b兩株，湖北十堰株，湖北五里株和湖北隨州株等7株斯氏并殖吸蟲在遺傳樹上呈現(xiàn)兩支，最后成一大支，其7株遺傳距離是0.00004～0.08401；湖北神農(nóng)架發(fā)現(xiàn)的并殖吸蟲，該株在進(jìn)化樹上獨立成一支，與衛(wèi)氏并殖吸蟲遺傳距離在0.01897～0.11278，與斯氏并殖吸蟲遺傳距離在0.013

7、55～0.12195；系統(tǒng)進(jìn)化樹通過MEGA4.0軟件所構(gòu)建的進(jìn)化樹中12株并殖吸蟲分為三類：江西武寧株、浙江蘭亭株、湖北咸寧株和湖北赤壁株等4株為衛(wèi)氏并殖吸蟲；湖北走馬a、b兩株，湖北五峰a、b兩株，湖北十堰，湖北五里和湖北隨州等7株為斯氏并殖吸蟲；湖北神農(nóng)架株獨立成一類，為尚不明確的一種并殖吸蟲。⑷湖北省存在兩個并殖吸蟲流行區(qū)：以衛(wèi)氏并殖吸蟲為主的鄂東南和以斯氏并殖吸蟲為主的鄂西兩個并殖吸蟲病流行區(qū)。
　　 結(jié)論：①根據(jù)基因

8、刪序分析的結(jié)果，3省10地12株并殖吸蟲在基因水平上分為3類：江西武寧株、浙江蘭亭株、湖北咸寧株和湖北赤壁株等4株為衛(wèi)氏并殖吸蟲；湖北走馬a、b兩株，湖北五峰a、b兩株，湖北十堰，湖北五里和湖北隨州等7株為斯氏并殖吸蟲；湖北神農(nóng)架株獨立成一類，為尚不明確的一種并殖吸蟲。②湖北省存在以衛(wèi)氏并殖吸蟲為主的鄂東南和以斯氏為主的鄂西兩個并殖吸蟲病流行區(qū)。③采用童蟲、成蟲和囊蚴等3個不同蟲期標(biāo)本，尤其是本實驗首次采用童蟲樣本，對研究并殖吸蟲遺傳變