單核細胞增生李斯特菌單克隆抗體制備及熒光微球免疫層析試紙條的研制.pdf

1、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種能引起人畜共患病的食源性致病菌。該菌可通過食物、水和動物糞便等傳播，在低溫4℃下仍能生長繁殖，人被LM感染后死亡率可達30％，在新生嬰幼兒和免疫力低下的人群中死亡率更高達70％。獲得高親和力李斯特菌特異性抗體是建立免疫學(xué)檢測李斯特菌的必要條件之一。
　　 本文以LM的細胞碎片免疫BALB/c小鼠，成功篩選獲得了4株穩(wěn)定分泌抗LM的單克隆雜交瘤細胞株4A7、4

2、H11、10A11、11E11?？贵w效價分別為1∶160000、1∶20000、1∶160000、1∶160000;抗體亞型分別為IgG1、IgG2a、IgG1、IgG2a。Dot-ELISA結(jié)果表明，4A7、10A11和4H11單克隆抗體具有很好的屬特異性。Western-blot分析表明，4A7，10A11可與LM62kDa外膜蛋白抗原表位結(jié)合;4H11抗體可與LM32kDa外膜蛋白抗原表位結(jié)合;11E11抗體結(jié)合的抗原分子量范圍為

3、14～24KDa，分析抗原成分可能是磷壁酸類物質(zhì)。膠體金免疫電鏡實驗進一步確證以上抗體可有效識別LM細胞表面抗原。
　　 將抗LM的四株單抗4A7、4H11、10A11、11E11與抗LM兔多抗LM2以及LM3配對，結(jié)果表明抗LM單抗4A7與兔多抗LM3可以配對。以兔多抗LM3標(biāo)記熒光微球，單抗4A7以及驢抗鼠IgG噴涂于硝酸纖維素膜上分別作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），初步建立了LM免疫層析試紙條的快速檢測方法。LM熒光微

4、球試紙條最佳實驗條件如下:兔多抗LM3最佳標(biāo)記量為50μg/mg（熒光微球）;NC膜上T線4A7抗體濃度為0.5mg/mL，質(zhì)控線驢抗鼠二抗?jié)舛葹?mg/mL;單次檢測熒光微球(5mg/mL)用量為7μL。試紙條免疫動力學(xué)分析表明，在加樣后的30min內(nèi)，試紙條T，C線熒光強度一直呈上升趨勢，未能達到平衡;而T/C比值在20min后達到平衡。在最佳實驗條件下，LM的最低檢測靈敏度為4.65×107CFU/mL。初步的適用性驗證實驗表明，