冷凍對(duì)精子凋亡及印記基因DNA甲基化修飾的長(zhǎng)時(shí)程效應(yīng)研究.pdf

1、精子冷凍保存是男性生殖能力延續(xù)的主要技術(shù)方法之一,在人類輔助生殖領(lǐng)域和精子庫(kù)樣品保存中應(yīng)用廣泛。據(jù)報(bào)道,人類精子在冷凍保存28年后成功復(fù)蘇,并借助輔助生殖技術(shù)成功受孕,但我們對(duì)擔(dān)負(fù)著繁衍后代重任的精子的要求,絕不僅僅是可以生育這么簡(jiǎn)單。近年來,越來越多的癌癥患者在進(jìn)行放、化療前有生殖力保存的愿望,而且在輔助生殖領(lǐng)域,一些少精癥或者高位截癱男性患者,為了實(shí)現(xiàn)繁衍后代的目的,必須通過附睪穿刺的方式獲得精子(不含精漿)并低溫冷凍保存,進(jìn)一步等

2、待合適的時(shí)機(jī)借助“試管嬰兒”技術(shù)孕育后代。伴隨著人類精液冷凍技術(shù)的廣泛使用,其安全性也受到了越來越多的關(guān)注。
　　低溫冷凍雖然可以延長(zhǎng)精子保存時(shí)間,但在冷凍過程中冰晶的形成、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及高溶質(zhì)引起的溶液效應(yīng)均有可能造成精子細(xì)胞膜、DNA完整性、線粒體功能等方面的損傷,進(jìn)一步影響到受精能力甚至胚胎質(zhì)量。表觀遺傳是一門真正將環(huán)境應(yīng)力與基因遺傳聯(lián)系在一起的學(xué)科,指在DNA序列不發(fā)生變化的情況下,基因表達(dá)卻發(fā)生了變化,而且這種變化能夠

3、在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中穩(wěn)定傳遞。其中DNA甲基化作為表觀遺傳的重要組成部分,因其發(fā)現(xiàn)較早和相對(duì)穩(wěn)定的遺傳基礎(chǔ)而備受關(guān)注。有研究顯示,胚胎印記基因的DNA甲基化易受到外界環(huán)境因素(溫度、滲透壓、體外操作等)的影響,而且這種DNA甲基化異常與男性不育以及胎兒印記基因缺陷疾病密切相關(guān),如父源印記基因H19印記控制區(qū)域的DNA甲基化修飾異常會(huì)引起絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤(rùn)能力下降以及SRS和BWS疾病的高發(fā),母源印記基因KvDMR1也與AS/BWS高發(fā)

4、密切相關(guān)。目前,國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于人類精子冷凍后的印記基因DNA甲基化修飾的損傷評(píng)估。因此,本研究從精子DNA完整性、DNA甲基化修飾兩個(gè)方面,綜合評(píng)估精子冷凍的安全性。
　　目的:
　　檢測(cè)冷凍及冷凍時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)精子凋亡以及精子印記基因(父源H19、母源KvDMR1)的印記控制區(qū)域(ICR)的DNA甲基化修飾的影響。
　　方法:
　　以15例健康男性精液為研究對(duì)象,將每份精液樣品除留少許作為對(duì)照外,其余分為兩部分(每

5、部分又等分為若干份),一部分連同精漿一起進(jìn)行程序化冷凍,另一部分通過Isolate法去除精漿后冷凍,并分別于冷凍后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月時(shí),通過亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR的方法分析H19,KvDMR1ICR的DNA甲基化狀態(tài)。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)去除精漿冷凍1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月后精子的凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.連同精漿一起冷凍的精子樣品,冷凍1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月后,父源印記基因H19ICR的DNA甲基化丟失

6、率分別為13.62±2.06％、14.88±1.96%、15.89±2.26%,與對(duì)照相比(12.74±2.85%)無顯著差異(P>0.05);母源印記基因KvDMR1ICR的DNA甲基化與對(duì)照相比無增加,即無顯著差異(P>0.05)。
　　2.去除精漿后冷凍的精子樣品,與對(duì)照相比(H19,12.74±2.85%),冷凍1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月后,父源印記基因H19ICR的DNA甲基化丟失率分別為15.24±1.91%(P>0.05

7、)、13.49±2.63%(P>0.05)和30.92±3.08%(P<0.01),母源印記基因KvDMR1ICR的DNA甲基化改變?cè)诶鋬?2個(gè)月內(nèi)與對(duì)照相比無顯著差異(P>0.05)。
　　3.進(jìn)一步對(duì)去除精漿冷凍1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月的精子樣品檢測(cè)其凋亡情況,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　在精子冷凍保存過程中,與DNA損傷相比,精子印記基因的DNA甲基化修飾,尤其是父源印記基因