纖維連接蛋白瓜氨酸化后對(duì)聚蛋白多糖酶-1活性的影響.pdf

1、目的:關(guān)節(jié)軟骨退變主要是由于細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而基質(zhì)的破壞主要是因?yàn)榫鄣鞍锥嗵堑慕到?。聚蛋白多糖酶屬于金屬蛋白酶ADAMTS家族，通過裂解聚蛋白多糖球間域的Glu(373)-Ala(374)位點(diǎn)來促進(jìn)聚蛋白多糖的降解。聚蛋白多糖酶-1(ADAMTS-4)和聚蛋白多糖酶-2(ADAMTS5)在降解關(guān)節(jié)軟骨聚蛋白多糖中起關(guān)鍵作用。FN在RA和OA的關(guān)節(jié)滑液和滑膜中均有表達(dá)，在RA滑膜中FN的表達(dá)尤為豐富，它的代謝可能參與了軟骨的降解，已有研

2、究發(fā)現(xiàn)FN的碳末端能夠與ADAMTS-4的碳末端結(jié)合，結(jié)合后ADAMTS-4的聚蛋白多糖酶活性被FN抑制，且抑制作用呈劑量依賴性。ADAMTS-4的聚蛋白多糖酶活性被FN抑制是可能是通過兩者之間的碳末端相互作用實(shí)現(xiàn)的，聚蛋白多糖的降解過程存在某種FN參與的細(xì)胞外調(diào)節(jié)機(jī)制。PADI4是PAD家族中的成員，PADI4可修飾翻譯后的肽基精氨酸，將其轉(zhuǎn)換為瓜氨酸，此過程即瓜氨酸化，一些蛋白質(zhì)被瓜氨酸化后其結(jié)構(gòu)及活性會(huì)發(fā)生改變。
　　 本

3、研究的目的是通過觀察聚蛋白多糖酶1(ADAMTS-4)與纖維連接蛋白(FN)以及瓜氨酸化的FN(cFN)的結(jié)合活性及結(jié)合后的酶解活性，探討ADAMTS-4的活性調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 材料和方法:帶有肝素結(jié)合域的分子量為的40kDaFN片段提純自糜蛋白酶消化的人血漿白蛋白，購自Millipore公司，此FN片段包含纖維連接蛋白的CS-1肝素結(jié)合域，與ADAMTS-4具有高結(jié)合活性。兔源PADI4購自Sigma公司，93kDa的全長(zhǎng)AD

4、AMTS-4蛋白由Origene公司制備，缺失碳端的53kDa的重組ADAMTS-4蛋白購自R&D公司，此蛋白自催化區(qū)開始到間隔區(qū)停止（Phe213-Cys685）?？笰DAMTS-4碳端、氮端、肽段多抗以及抗瓜氨酸多抗購自Abcam公司。測(cè)定ADAMTS-4酶解活性的聚蛋白多糖酶活性分析試劑盒購自Abnova公司。此試劑盒通過測(cè)定聚蛋白多糖酶分解聚蛋白多糖底物ARGSVIL片段的濃度來反應(yīng)聚蛋白多糖酶的酶解活性。應(yīng)用肽基精氨酸脫亞胺酶

5、4(PADI4)對(duì)纖維連接蛋白(FN)進(jìn)行瓜氨酸化并采用蛋白印跡法進(jìn)行驗(yàn)證;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法比較FN和cFN與2種不同分子量的ADAMTS-4的結(jié)合活性;使用聚蛋白多糖酶活件分析試劑盒測(cè)定2種ADAMTS-4的活性和其與FN、cFN結(jié)合后酶活性的變化。數(shù)值結(jié)果應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:

6、
　　 (1)蛋白印跡法證實(shí)兔源PADI4可以使來源于人血漿纖維蛋白原的分子為40000的纖維連接蛋白片段瓜氨酸化為瓜氨酸化的纖維連接蛋白片段。
　　 (2)瓜氨酸化后的纖維連接蛋白與相對(duì)分子質(zhì)量為93000的ADAMTS-4的結(jié)合活性明顯低于未瓜氨酸化的纖維連接蛋白(分別為0.624±0.033，2.182±0.042，t=50.522，P=9.186E-07)，而兩者與缺失碳端的相對(duì)分子質(zhì)量為53000的ADAMTS

7、-4的結(jié)合活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為0.934±0.012,0.971±0.024, t=2.388, P=0.075)。
　　 (3)相對(duì)分子質(zhì)量為93000的ADAMTS-4能夠酶解聚蛋白多糖產(chǎn)生大量酶解產(chǎn)物[ARGxx肽段濃度;（0.908±0.088）nmol/L]，與纖維連接蛋白結(jié)合后降解聚蛋白多糖的能力明顯下降[ARGxx肽段濃度:（0.573±0.000）nmol/L，t=6.594，P=0.003]，與瓜氨酸化

8、的纖維連接蛋白孵育后的ADAMTS-4降解聚蛋白多糖產(chǎn)生的ARGxx肽段濃度（0.830±0.020 nM）明顯高于與未瓜氨酸化的纖維連接蛋白（0.573±0.000 nmol/L）孵育后的ADAMTS-4(t=22.257，P=2.413E-05)。
　　 (4)相對(duì)分子質(zhì)量為53000的ADAMTS-4的酶活性明顯高于相對(duì)分子量為90000的ADAMTS-4，而且在與纖維連接蛋白或瓜氨酸化的纖維連接蛋白孵育前后酶活性無明顯變

9、化(P值分別為0.092、0.094)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)在PADI4的參與下，F(xiàn)N可被瓜氨酸化為cFN。
　　 (2) FN能夠結(jié)合相對(duì)分子質(zhì)量為90000的ADAMTS-4，并使它的酶解活性明顯下降。cFN與相對(duì)分子質(zhì)量為90000的ADAMTS-4的結(jié)合活性明顯低于FN，且抑制ADAMTS-4活性的作用也明顯減弱。
　　 (3)缺失碳端的相對(duì)分子質(zhì)量為53000的ADAMTS-4表現(xiàn)出強(qiáng)烈