環(huán)磷酰胺及長春新堿對睪丸支持細胞間隙連接蛋白表達的影響.pdf

1、背景與目的：
　　環(huán)磷酰胺及長春新堿因抗腫瘤效果良好,是臨床上常用的化療藥物,而化療藥物常對生殖細胞有毒副作用。
　　環(huán)境中的有毒物質或其體內代謝產(chǎn)生的有害毒物要作用于生精細胞,必需要先通過血睪屏障,而在與生精細胞接觸前,需先要經(jīng)過睪丸支持細胞,或者是通過影響支持細胞的功能而進一步對生殖細胞發(fā)揮作用。大量實驗證實,支持細胞是多種有毒物質作用的靶細胞,進而影響生殖細胞。
　　目前已有較多實驗證實對生殖細胞的有害物質能減少

2、支持細胞的連接蛋白,使支持細胞上的間隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)的表達數(shù)量減少,從而影響細胞間縫隙連接通訊的功能,進一步影響到睪丸支持細胞對精子發(fā)生的正常功能,致使生殖細胞功能及發(fā)育異常。因此,我們推測長春新堿、環(huán)磷酰胺影響睪丸支持細胞CX43的表達是其雄性生殖毒副作用的可能機制之一。
　　本研究以不同濃度環(huán)磷酰胺及長春新堿加入小鼠睪丸支持細胞進行培養(yǎng)、細胞毒實驗,并采用不同方法檢測支持細胞胞間Cx43表達情況

3、,了解環(huán)磷酰胺及長春新堿是否減少睪丸支持細胞表達CX43蛋白,評估兩種藥物是否對睪丸支持細胞的間隙連接通訊功能產(chǎn)生影響。
　　實驗方法
　　小鼠睪丸支持細胞培養(yǎng),分別用不同濃度環(huán)磷酰胺、長春新堿加入細胞行培養(yǎng),用MTT法檢測細胞增殖及細胞毒性,確定環(huán)磷酰胺及長春新堿實驗藥物濃度。選取環(huán)磷酰胺長春新堿實驗藥物濃度分別作用支持細胞6小時、12小時、24小時及48小時結果行RT-PCR分析。同理,選取環(huán)磷酰胺長春新堿最佳藥物濃度分

4、別作用支持細胞培養(yǎng),行免疫熒光染色檢測培養(yǎng)的支持細胞中Cx43蛋白的表達。
　　結果：
　　細胞毒性試驗結果提示,隨著藥物劑量的加大,支持細胞的存活率進行性下降,為避免細胞過多死亡影響Cx43的表達,確定環(huán)磷酰胺4ug/ml、長春新堿40ug/L為實驗藥物濃度。RT-PCR分析結果顯示,經(jīng)培養(yǎng)后,內參GAPDHmRNA在4個時間點無明顯變化,而環(huán)磷酰胺、長春新堿作用6h,12h,24h,48h后,Cx43mRNA隨時間延長表

5、達逐步下降,且環(huán)磷酰胺較長春新堿作用明顯,說明環(huán)磷酰胺及長春新堿對睪丸支持細胞表達CX43有明顯抑制作用。免疫熒光染色檢測結果顯示,代表CX43的綠色熒光斑,正常對照組光斑密度大,而環(huán)磷酰胺及長春新堿作用后光斑密度明顯減少,并且環(huán)磷酰胺較長春新堿作用明顯。
　　結論：
　　環(huán)磷酰胺及長春新堿能減少睪丸支持細胞的CX43蛋白表達,進而抑制間隙連接通訊功能,且環(huán)磷酰胺較長春新堿作用更明顯。環(huán)磷酰胺及長春新堿對睪丸支持細胞有毒性,