棉酚對(duì)睪丸支持細(xì)胞間隙連接蛋白43表達(dá)的調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、棉酚具有顯著的抗男性生育效果，其作為男性避孕藥的研究己經(jīng)進(jìn)行了將近三十年。國(guó)內(nèi)外對(duì)棉酚和有關(guān)化合物作為避孕藥的作用機(jī)理、體內(nèi)代謝、毒性和臨床效果等方面進(jìn)行了廣泛系統(tǒng)的研究，但至今其具體作用機(jī)制目前仍不清楚。
　　 鑒于以上原因，研究棉酚的男性抗生育機(jī)制是男科學(xué)一項(xiàng)十分有意義的工作。
　　 支持細(xì)胞（Sertoli cell ）是雄性哺乳動(dòng)物睪丸曲細(xì)精管內(nèi)唯一的體細(xì)胞，可以維持和調(diào)節(jié)正常的生精過(guò)程，在精子發(fā)育成熟的過(guò)程中具

2、有極為重要的作用。
　　 Sertoli 細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)生精細(xì)胞的增殖和成熟十分關(guān)鍵，其改變可導(dǎo)致生精細(xì)胞的脫落和死亡。
　　 間隙連接(gap junction,GJ)是位于細(xì)胞胞膜上連接相鄰細(xì)胞間的通路,允許小分子及離子物質(zhì)交換,其主要生化成分為連接蛋白(connexin,Cx)。睪丸中最主要的連接蛋白是connexin43(Cx43)，主要位于曲細(xì)精管的基底層Sertoli 細(xì)胞之間的血睪屏障以及Ser

3、toli 細(xì)胞和生精細(xì)胞之間。
　　 近期有多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道，林丹、鎘等毒素能減少Sertoli 細(xì)胞的連接蛋白,并使Sertoli 細(xì)胞上Cx43 的數(shù)量減少，從而影響間隙連接通訊(GJIC)的功能，進(jìn)一步影響到睪丸Sertoli 細(xì)胞在精子發(fā)生過(guò)程的正常功能，并對(duì)睪丸腫瘤的發(fā)生可能也有影響。因此，我們推測(cè)棉酚對(duì)雄性生殖功能的影響可能也首先從Sertoli 細(xì)胞開(kāi)始。
　　 本實(shí)驗(yàn)的目的是研究棉酚對(duì)睪丸支持細(xì)胞的毒性作用，

4、檢測(cè)支持細(xì)胞的間隙連接功能，進(jìn)一步探討棉酚作用下睪丸支持細(xì)胞膜上間隙連接蛋白表達(dá)的變化，從而明確棉酚對(duì)支持細(xì)胞間隙連接的影響。對(duì)于研究棉酚的抗生育作用具有重要意義，對(duì)于我們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)低毒性男性避孕藥有指導(dǎo)意義，同時(shí)也可為研究其他環(huán)境毒性物質(zhì)機(jī)理提供新思路。
　　 在課題的第一部分，采用TM4 細(xì)胞株，通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)確定棉酚染毒劑量，選定不同濃度（1.25,2.5,5,10 μmol/L ）棉酚分別處理細(xì)胞（6,12,24

5、，48h ），應(yīng)用劃痕標(biāo)記熒光染料示蹤技術(shù)檢測(cè)Sertoli 細(xì)胞GJIC 的功能變化，進(jìn)一步采用RT-PCR 、western blot 及細(xì)胞免疫熒光法分別從RNA 水平、蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞分布變化來(lái)探討棉酚對(duì)支持細(xì)胞間隙連接的影響。課題的第二部分，改進(jìn)睪丸支持細(xì)胞的分離方法，在體外分離培養(yǎng)小鼠睪丸支持細(xì)胞。分別用Feulgen 染色法及檢測(cè)Fas -L 表達(dá)等方法來(lái)鑒定支持細(xì)胞的純度，并用RT-PCR 檢測(cè)棉酚對(duì)原代培養(yǎng)的支持細(xì)胞

6、上間隙連接的影響。課題第三部分，給成年雄性小鼠胃飼15mg/kg/d 棉酚后分別觀察4 周、8 周及12 周睪丸的曲細(xì)精管，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)支持細(xì)胞上間隙連接的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，棉酚對(duì)TM4 細(xì)胞有抑制作用。當(dāng)棉酚濃度<10 -5 mol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率大于90％，對(duì)TM4 細(xì)胞的存活率無(wú)明顯影響；濃度>5 ×10 -4 mol/L 時(shí),對(duì)Sertoli 細(xì)胞存活率的影響隨著劑量增大而降低，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，

7、EC50 為1.5×10 -5 mol/L 。當(dāng)棉酚濃度為5 ×10 -3 mol/L 時(shí)，存活率明顯降低，細(xì)胞存活率<3％，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。5 μmol/L 棉酚作用TM4 支持細(xì)胞24 小時(shí)結(jié)果與空白對(duì)照組比較，2mm 長(zhǎng)度內(nèi)劃痕兩側(cè)綠色熒光負(fù)載細(xì)胞數(shù)目，空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)為1079.3 ±290.0 ，棉酚組為305.6 ±134.2 。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)，提示棉酚用藥后TM4 細(xì)胞間隙連接

8、功能明顯下降。5 μmol/L 棉酚分別作用TM4 支持細(xì)胞6 小時(shí),12 小時(shí),24 小時(shí)及48 小時(shí)后RT-PCR 結(jié)果提示Cx43 mRNA 在各組細(xì)胞中均有表達(dá)，但隨棉酚處理時(shí)間增加而逐漸下降。與空白組相比，24 小時(shí)組與48 小時(shí)組Cx43 mRNA 的量均顯著下降(P<0.05)。1.25,2.5,5 及10 μmol/L 棉酚分別處理TM4 支持細(xì)胞24 小時(shí)后Westernblot 結(jié)果提示Cx43 蛋白在各劑量組均有表

9、達(dá)，但表達(dá)量隨濃度的增加逐步下降，5 μmol/L 及10 μmol/L 組中的表達(dá)量均明顯低于空白組（P <0.05 ）。1.25,2.5 及10 μmol/L 棉酚作用TM4 支持細(xì)胞24 小時(shí)后行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果可見(jiàn)，棉酚作用組與對(duì)照組表達(dá)相比較，陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度較正常組均降低，且隨劑量增加Cx43 蛋白熒光表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱。1.25 μmol/L及2.5 μmol/L 組Cx43 表達(dá)陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低，未見(jiàn)有強(qiáng)陽(yáng)性

10、表達(dá)，10μmol/L 組只有極少部分為弱陽(yáng)性表達(dá)，位于細(xì)胞漿，呈淡綠色斑點(diǎn)狀，未見(jiàn)位于細(xì)胞膜。在實(shí)驗(yàn)的第二部分，成功分離了的原代的小鼠睪丸支持細(xì)胞，純度可達(dá)85％以上，RT-PCR 分析提示棉酚對(duì)其也存在抑制間隙連接蛋白的作用。實(shí)驗(yàn)的第三部分，對(duì)小鼠進(jìn)行15 mg/kg/d 劑量棉酚處理實(shí)驗(yàn)表明，胃飼棉酚4 周小鼠睪丸曲細(xì)精管的形態(tài)無(wú)明顯改變，但從8 周開(kāi)始，支持細(xì)胞膜上的間隙連接蛋白的表達(dá)減少，12 周時(shí)間隙連接蛋白明顯減少，提示棉

11、酚對(duì)睪丸支持細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)有抑制作用。由此我們得出結(jié)論，正常Sertoli 細(xì)胞存在大量間隙連接通訊，主要成分為Cx43 。棉酚能抑制Sertoli 細(xì)胞的間隙連接通訊功能，而細(xì)胞上Cx43 表達(dá)的減少是其功能受損的物質(zhì)基礎(chǔ)。低劑量棉酚處理小鼠，曲細(xì)精管上皮周期頻率沒(méi)有明顯紊亂，精子發(fā)生過(guò)程沒(méi)有被嚴(yán)重破壞，預(yù)示了其作用的可逆性。但其可損傷睪丸Sertoli 細(xì)胞上Cx43 的表達(dá)，進(jìn)而可影響小鼠睪丸Sertoli 細(xì)胞的功能，為棉酚