微小RNA-206及其靶基因GJA1（間隙連接蛋白43基因）在激素性股骨頭壞死中的作用研究.pdf

1、目的：
　　目的：
　　miRNA是生物體內(nèi)源長度約為21個核苷酸左右的非編碼小RNA，通過與靶mRNA分子3'末端非翻譯區(qū)域(3'-untranslated region，3'UTR)互補(bǔ)配對而在轉(zhuǎn)錄水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制或者降解從而發(fā)揮生物調(diào)控功能[1]?，F(xiàn)有研究表明骨組織的發(fā)生、生長、代謝同樣與miRNA有著密切的關(guān)聯(lián)。連接子蛋白43(connexin43，Cx43)是骨組織中主要的間隙連

2、接(gap junction)蛋白和半通道(hemichannel)蛋白，由Cx43形成的間隙連接及半通道實(shí)現(xiàn)了骨組織細(xì)胞間的直接通訊，對骨組織的正常發(fā)育、骨重建過程的建立與平衡起重要作用[2，3]。已有研究表明miRNA-206以間隙連接蛋白43為靶基因?qū)Τ晒羌?xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響[4]。而成骨細(xì)胞是骨發(fā)育重建過程中最重要細(xì)胞之一，在骨骼發(fā)育成熟和修復(fù)重建中具有重要作用，其數(shù)量、功能的改變與股骨頭壞死密切相關(guān)[5,6]。我們假設(shè)激素

3、性股骨頭壞死的病理發(fā)生發(fā)展與Cx43/miRNA-206調(diào)控的成骨細(xì)胞分化通路相關(guān)。本實(shí)驗以miRNA-206為中心，從分子生物學(xué)水平、細(xì)胞水平對Cx43/miRNA-206調(diào)控的成骨細(xì)胞分化通路在激素性股骨頭壞死中的作用深入研究，為研究激素性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
　　方法與結(jié)果：
　　一、miRNA-206及其靶基因GJA1（間隙連接蛋白43基因）在激素性股骨頭壞死骨組織中的表達(dá)變化
　　方法:<

4、br>　　(1)收集激素性股骨頭壞死與股骨頸骨折行全髖置換手術(shù)患者的股骨頭標(biāo)本46例，其中激素性股骨頭缺血性壞死（實(shí)驗組）26例;新鮮股骨頸骨折（對照組）20例
　　(2)HE染色觀察兩組股骨頭組織形態(tài)變化
　　(3)免疫組織化學(xué)檢測CX43蛋白在股骨頭的表達(dá)
　　(4)提取患者股骨頭總RNA實(shí)時熒光定量PCR檢測兩組股骨頭miRNA-206及CX43mRNA的表達(dá)情況
　　(5)提取患者股骨頭總蛋白質(zhì)，west

5、ern blot定量檢測股骨頭CX43蛋白的表達(dá)
　　結(jié)果:
　　(1)HE染色:實(shí)驗組:骨小梁壞死，細(xì)胞核消失，骨髓造血及微循環(huán)障礙;對照組:骨小梁內(nèi)有少量壞死骨細(xì)胞，骨髓腔造血細(xì)胞增生活躍。
　　(2)免疫組化:Cx43蛋白陽性表達(dá)于骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及細(xì)胞與細(xì)胞之間的胞膜和胞漿上。
　　(3)熒光定量PCR:miRNA-206在實(shí)驗組的表達(dá)量是對照組的4.3倍，兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，CX43mR

6、NA在對照組的表達(dá)是實(shí)驗組的2.4倍，兩者間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　(4)Western blot: CX43蛋白的表達(dá)在實(shí)驗組中低于對照組，兩者具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　二、miRNA-206通過抑制Cx43的表達(dá)而參與成骨細(xì)胞的調(diào)控
　　方法:
　　(1)成骨細(xì)胞株人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞株購于（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）;
　　(2)向原代成骨細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miRNA-206的mimic（

7、模擬劑）和inhibitor（抑制劑）及陰性對照N.C;
　　(3)采用qRT-PCR檢測miRNA-206、Cx43的mRNA表達(dá)及Western-blot方法檢測Cx43蛋白表達(dá)水平，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，ALP底物顯色反應(yīng)來評價轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞功能變化。
　　結(jié)果:
　　(1)轉(zhuǎn)染miRNA-206 mimic后，細(xì)胞中miRNA-206表達(dá)明顯增加，Cx43蛋白表達(dá)下降，與陰性對照比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜

8、0.05)，Cx43mRNA表達(dá)不變，與陰性對照比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);成骨細(xì)胞數(shù)量與N.C.對照組相比均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);成骨細(xì)胞特異性分化標(biāo)志物ALP活性下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(2)轉(zhuǎn)染miRNA-206inhibitor后，細(xì)胞中miRNA-206表達(dá)明顯下降，Cx43蛋白表達(dá)增加，與陰性對照比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)Cx43mRNA表達(dá)不變，與陰性對照

9、比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);成骨細(xì)胞數(shù)量與正常對照組和N.C.對照組相比均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);成骨細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，成骨細(xì)胞特異性分化標(biāo)志物ALP活性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)在激素性股骨頭壞死骨組織中，miRNA-206表達(dá)上調(diào)，CX43表達(dá)下調(diào);
　　(2)miRNA-206通過抑制Cx43的表達(dá)，從而抑制成骨細(xì)胞增殖、分化;
　　(3)