G6PD缺乏癥胚胎植入前遺傳學診斷體系的建立.pdf

1、研究背景:
　　植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis,PGD）是在胚胎植入子宮前進行的最早期的產(chǎn)前遺傳學診斷，是杜絕致病基因垂直傳播的最有效方法。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）缺乏癥，是世界上最常見的酶缺陷病之一，為X連鎖不完全顯性遺傳。臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為溶血性貧血和以未結(jié)合膽紅素升高為特點的高膽

2、紅素血癥。成年患者最嚴重的威脅是出現(xiàn)急性腎衰竭，而新生兒期發(fā)病則可導致核黃疸，造成永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷甚至死亡。該病是聯(lián)合國衛(wèi)生組織6種主要應該預防和控制的遺傳病之一，亦是廣東省及深圳市出生缺陷干預工程的干預病種之一。目前國內(nèi)外主要通過性別選擇避免有表型的胚胎移植，尚無針對G6PD基因PGD的報道。簡單的性別選擇并不適用于所有G6PD缺乏癥夫婦，只有通過針對性的G6PD基因的檢測才能最有效地阻斷該基因的垂直傳播，達到優(yōu)生目的。故建立G6P

3、D基因PGD診斷意義深遠。
　　研究目的:
　　（1）應用巢式PCR聯(lián)合多重SNaPshot技術，建立穩(wěn)定、快速、準確的單細胞G6PD基因診斷方法，并評估巢式PCR法在G6PD缺乏癥PGD中的可行性。
　?。?）應用全基因組擴增（whole genome amplification,WGA）技術，聯(lián)合多重SNaPshot微測序和單倍型分析，建立可監(jiān)測污染和等位基因脫扣（allele drop out，ADO）發(fā)生與否的

4、單細胞G6PD基因診斷體系，并評估該體系在G6PD缺乏癥PGD中的可行性。
　　研究方法:
　?。?）獲取單淋巴細胞，應用巢式PCR結(jié)合多重SNaPshot技術建立對G6PD基因突變高發(fā)的Exo n2、9、11、12四個外顯子上的12個突變位點的單細胞基因診斷方法。
　?。?）分別獲取單淋細胞、單卵裂球及滋養(yǎng)層細胞，在 WGA技術基礎上應用多重SNaPshot技術檢測25個已報道的中國人群G6PD基因突變位點，并聯(lián)合X

5、q28上6個短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）位點的單倍型分析技術及Amelogenin基因的性別診斷技術建立G6PD缺乏癥PGD診斷體系。
　　研究結(jié)果:
　?。?）應用多重巢式PCR結(jié)合SNaPshot技術在單細胞水平上成功建立檢測Exon2、Exon9、Exon11、Exon12上12個G6PD突變位點的基因診斷方法，檢測58個正常和108個雜合子單淋巴細胞，擴增效率為90.97％，ADO

6、率為8.08%。
　?。?）聯(lián)合應用WGA技術、SNaPshot基因分型技術、單倍型分析技術和性別診斷技術，在單細胞水平上成功建立既可擴增所有能發(fā)生突變的外顯子，檢測25個已報道的中國人群G6PD基因突變位點，又能同時監(jiān)測污染或ADO的診斷體系。檢測60個正常和96個雜合子單淋巴細胞，WGA擴增效率為94.23%；成功擴增的 WGA產(chǎn)物在后續(xù)基因檢測的總擴增效率為89.37%，總的 ADO率為13.74%，各項基因間的擴增效率和A

7、DO率有統(tǒng)計差異（P<0.05）。檢測24個單卵裂球，WGA擴增效率為95.83%；成功擴增WGA產(chǎn)物在后續(xù)基因檢測的總擴增效率為92.39%，總的ADO率為10.00%，各項基因間的擴增效率無統(tǒng)計差異（P>0.05）?；顧z8個囊胚的滋養(yǎng)層細胞，WGA均擴增成功，后續(xù)實驗中亦未見基因擴增失敗，滋養(yǎng)層細胞的檢測結(jié)果均與對應的囊胚陽性對照一致，未見ADO發(fā)生。
　?。?）比較所建立的兩種方法對單淋巴細胞的檢測效果，巢式PCR法的擴增效

8、率更高（90.97%v s.78.21%，P=0.001），ADO率更低（8.08%v s.19.48%，P=0.026），差異均有統(tǒng)計學意義。WGA法可擴增檢測更多的外顯子和突變位點，并可在G6PD基因分型的同時，監(jiān)測是否存在污染或ADO的可能性，診斷結(jié)果更為準確可靠。
　　結(jié)論:
　　（1）所建立的多重巢式PCR結(jié)合SNaPshot技術具有擴增效率高、ADO率低、時效性好和成本低等優(yōu)點，可在單細胞水平上快速、準確地檢測1

9、2個G6PD基因突變位點。
　?。?）在單細胞水平上聯(lián)合應用WGA技術、SNaPshot基因分型技術、性別診斷技術和單倍型分析技術所建立的G6PD基因診斷體系，適用于25個G6PD基因突變位點的PGD。雖然擴增效率較低和ADO率較高，但可通過單倍型分析的結(jié)果來提示是否存在污染或ADO的可能性，從最大程度上保證診斷結(jié)果的可靠性，減少PGD的誤診率。
　　（3）通過進行囊胚期胚胎的滋養(yǎng)層細胞活檢，獲得多個細胞進行PGD，可有效彌