非洲豬瘟病毒K205R基因的原核表達(dá)及金標(biāo)試紙的初步研制.pdf

1、非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的急性傳染病，以急性高熱為特點，伴有全身及全身內(nèi)臟器官出血，豬群一旦感染，發(fā)病率和死亡率均可達(dá)到100％，被OIE列為通報疫病。ASF的臨床表現(xiàn)與豬瘟極其相似，極易造成誤診，目前我國尚無ASFV，要嚴(yán)格防范，對相關(guān)的進(jìn)口產(chǎn)品快速診斷和監(jiān)測是防止本病傳入我國的關(guān)鍵技術(shù)之一，本試驗運用原核表達(dá)系統(tǒng)和膠體金免疫層析技術(shù)，對ASFV快速檢測試紙條的技術(shù)進(jìn)行了初步研究。
　　首先本試驗運

2、用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了ASFV K205R基因的表達(dá)蛋白:利用人工合成技術(shù)獲得含有ASFV K205R基因的pMDTM19-T Simple載體，經(jīng)NotⅠ、BgiⅡ限制性內(nèi)切酶酶切獲得K205R基因片段;將pET32a質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ、BgiⅡ限制性內(nèi)切酶雙酶切回收目的產(chǎn)物，并與K205R基因進(jìn)行連接，經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定及測序鑒定，結(jié)果顯示重組原核表達(dá)系統(tǒng)pET32a-K205R質(zhì)粒構(gòu)建成功;將重組質(zhì)粒pET32a-K205R轉(zhuǎn)入表

3、達(dá)載體BL21大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，可在大約44 kDa處獲得特異性蛋白條帶，并優(yōu)化確定了37℃、1 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)表達(dá)3h為最佳誘導(dǎo)條件。SDS-PAGE分析顯示重組菌株所表達(dá)的K205R基因蛋白主要分布在菌液上清中，且表達(dá)量遠(yuǎn)大于其他菌體表達(dá)蛋白。經(jīng)Ni-TED親和層析法得到K205R純化蛋白，通過免疫家兔制備抗ASFV K205R蛋白的血清，ELISA結(jié)果顯示所獲得的K205R純化蛋白能與陽性血清反應(yīng)，說

4、明純化蛋白具有免疫原性。
　　利用檸檬酸三鈉還原法制備不同直徑大小的膠體金顆粒，肉眼觀察膠體金溶液澄清透明，無可見漂浮物，紫外分光光度計掃描結(jié)果顯示，100 ml0.01％氯金酸溶液中加入2.2 ml1％檸檬酸三鈉溶液所制備的膠體金顆粒均勻，此時制備的膠體溶液為酒紅色，直徑在10 nm～20 nm，可用于標(biāo)記蛋白。根據(jù)膠體金免疫層析的原理，本試驗用兔抗K205R抗體標(biāo)記金顆粒并作為金標(biāo)墊，用兔抗K205R抗體作為檢測線(T線)捕獲

5、K205R蛋白，用葡萄球菌A蛋白(SPA)作為質(zhì)控線（C線）;經(jīng)過對工作條件的優(yōu)化，確定金標(biāo)兔抗K205R抗體的最佳標(biāo)記量為40μg/ml，最佳pH值為7.5，T線抗體濃度為1.5 mg/ml，C線SPA濃度為2 mg/ml。經(jīng)檢測，所研制的膠體金試紙條能與表達(dá)K205R蛋白反應(yīng)，不能與BL21大腸桿菌裂解液、豬瘟病毒(CSFV)、藍(lán)耳病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PRV)、圓環(huán)病毒(PCV)等反應(yīng)，對K205R表達(dá)蛋白的最小檢測量大