抑制VEGF表達(dá)的錘頭狀核酶系統(tǒng)的建立與評(píng)估.pdf

1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是腫瘤血管新生過(guò)程中的重要因子，是抗血管新生的腫瘤基因治療的重要靶點(diǎn)，本論文旨在建立和評(píng)估抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的錘頭狀核酶(hammerheadribozyme)技術(shù)系統(tǒng)，探討該系統(tǒng)在抗血管新生的腫瘤基因治療中可能的應(yīng)用。 為了建立和評(píng)估抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的錘頭狀核酶技術(shù)系統(tǒng)，我們運(yùn)用了如下技術(shù)手段：1，對(duì)VEGFl21基因mRNA序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，選擇靶點(diǎn)；2，設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)VEGF的

2、分泌肽mRNA的可表達(dá)錘頭狀核酶(1—4)載體系統(tǒng)和VEGF一熒光色素酶融合基因報(bào)告質(zhì)粒；3，通過(guò)試管內(nèi)切割實(shí)驗(yàn)等方法評(píng)估核酶對(duì)于試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到的VEGFRNA切割有效性和效率；4，通過(guò)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)評(píng)估核酶在細(xì)胞內(nèi)對(duì)于VEGFmRNA的切割效率；5，通過(guò)構(gòu)建缺陷型腺病毒導(dǎo)入系統(tǒng)評(píng)估核酶在細(xì)胞內(nèi)對(duì)于mRNA的切割效果；6，通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)核酶的細(xì)胞株的裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)估抑制VEGF對(duì)于腫瘤形成和生長(zhǎng)的作用。 研究結(jié)果顯示

3、：1，設(shè)計(jì)和構(gòu)建了對(duì)VEGFl2lmRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)水平上的暴露區(qū)(+8，+36，和+71位點(diǎn)：核酶1，3和4)和非暴露區(qū)(+17：核酶2)四個(gè)錘頭狀核酶(1～4)質(zhì)粒；2，試管內(nèi)切割檢測(cè)表明，針對(duì)+8，+36，和+71位點(diǎn)的核酶(1，3和4)可以有效地在試管內(nèi)對(duì)VEGF121RNA進(jìn)行特異性切割，使其水平分別降至對(duì)照的61．7％，27．6％和44．8％(熒光色素酶活性)或66．3％,27．0％和30．0％(蛋白質(zhì)水平)；3，將核酶表達(dá)質(zhì)

4、粒與VEGF-LUC模板質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染入SMMC一7721肝癌細(xì)胞，核酶1，3和4VEGF—LUC水平分別降低到對(duì)照的81．4％，56．6％和69．1％；4，穩(wěn)定表達(dá)針對(duì)VEGF的核酶1，3或4的SMMC一7721細(xì)胞株中，內(nèi)源性VEGFRNA的水平降至對(duì)照水平的5％；5，構(gòu)建了復(fù)制缺陷型腺病毒核酶導(dǎo)入系統(tǒng)；6，穩(wěn)定表達(dá)核酶的細(xì)胞株裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，核酶3號(hào)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 綜上，我們構(gòu)建的分別針對(duì)VEGFl2l+8，+36