TGF-β1轉(zhuǎn)染大鼠脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?探討大鼠脂肪干細(xì)胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及表型鑒定方法。研究應(yīng)用TGF-β1基因轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs，誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化，比較目的基因的分泌情況及向軟骨細(xì)胞分化效果，為軟骨組織工程學(xué)種子細(xì)胞提供新方法。 實(shí)驗(yàn)方法： 先行質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-TGF-β1擴(kuò)增、提取和酶切鑒定。取大鼠大網(wǎng)膜及腎周脂肪囊等處脂肪組織，眼科剪剪碎，加入3倍

2、體積0.1％的Ⅰ型膠原酶，酶消化法及密度梯度離心法相結(jié)合，分離、純化SD大鼠ADSCs，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)各代ADSCs的形態(tài)。取第3代脂肪干細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)其表面抗原CD29、CD44、CD106、CD34表達(dá)。將TGF-β1基因轉(zhuǎn)染ADSCs，按轉(zhuǎn)染情況分為4組：未轉(zhuǎn)染組(A組)、轉(zhuǎn)染空載體組(B組)、轉(zhuǎn)染TGF-β1組(C組)、轉(zhuǎn)染TGF-β1組(D組)。對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行篩選，MTT法測(cè)定篩選后細(xì)胞的增殖活性，RT-PCR檢測(cè)

3、TGF-β1、SOX9、Aggrecan和Collagen Ⅱ(Coill-Ⅱ)mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)TGF-β1、Coill-Ⅱ蛋白表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、TGF-β1質(zhì)粒鑒定測(cè)序結(jié)果與GenBank基因序列相符。 2、原代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞ld即可在培養(yǎng)皿內(nèi)見(jiàn)細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞呈類圓形；2d后長(zhǎng)梭形細(xì)胞逐漸增多；4-5d后細(xì)胞呈典型團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，形成集落；約7d左右細(xì)胞融合超過(guò)90％時(shí)；3代后

4、細(xì)胞形態(tài)比較均一，呈大長(zhǎng)梭形。 3、大鼠ADSCs的鑒定：免疫熒光法檢測(cè)ADSCs CD44、CD29呈陽(yáng)性反應(yīng)，CD106、CD34呈陰性反應(yīng)。 4、MTL法檢測(cè)：轉(zhuǎn)染基因?qū)DSCs增殖活性的影響 C、D組的吸光度值明顯高于A、B組，與A、B組之間的差異具有顯著性(P<0.01)，而C組和D組、A組和B組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 5、RT-PCR檢測(cè)：TGF-β1、SOX9、Aggrecan、C

5、oll-IImRNA表達(dá)mRNA顯示C、D組TGF-β1、SOX9、Coll-II、和Aggrecan的mRNA表達(dá)增強(qiáng)。除TGF-β1在A、B組表達(dá)外(A、B組比較P>0.05)，余下各檢測(cè)指標(biāo)在未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)空載體組均未見(jiàn)表達(dá)。 6、Western blot檢測(cè)：TGF-β1、Coll-II蛋白表達(dá)C、D組的TGF-β1、Coll-II的蛋白表達(dá)高于A、B組，差異具有顯著性(P<0.01)，A、B組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

6、>0.05)。 結(jié)論： 大鼠ADSCs經(jīng)分離，純化，擴(kuò)增，生物學(xué)性狀穩(wěn)定。ADSCs能穩(wěn)定地表達(dá)CD29、CD44，CD106、CD34表達(dá)陰性，證明其為干細(xì)胞來(lái)源。轉(zhuǎn)染TGF-β1后ADSCs細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGF-β1后的ADSCs能夠持續(xù)表達(dá)和分泌TGF-β1基因和蛋白。轉(zhuǎn)染TGF-β1基因后的ADSCs成功表達(dá)軟骨細(xì)胞的特異性基質(zhì)，具有了軟骨細(xì)胞的生化特征。采用脂質(zhì)體作為載體，安全、無(wú)毒副作用，經(jīng)基因