人工合成寡糖促進(jìn)乙型肝炎病毒抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Heptitis B virus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科，具有嚴(yán)格宿主特異性。HBV感染引起的乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，可引起急性或慢性肝炎，并且與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。盡管乙型肝炎病毒疫苗和藥物在臨床上廣泛應(yīng)用以及新的疫苗和藥物的深入研究，但是乙型肝炎病毒感染仍然是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重要因素，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告目前在全球范圍內(nèi)約有4億的人群是乙型肝炎病毒的攜帶者，而且每年仍然有5千萬的人群感

2、染HBV。因此開發(fā)新的HBV預(yù)防和治療性疫苗顯得尤為重要，本文主要在此背景下研究人工合成寡糖(在本文中命名為β寡糖)作為佐劑對(duì)乙肝疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的影響。 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)作為疫苗在臨床上被廣泛應(yīng)用于預(yù)防HBV感染，能產(chǎn)生高親和力的中和抗體，與病毒相互作用產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防HBV感染目的。雖然HBsAg被認(rèn)為是目前有效的HBV預(yù)防疫苗，但是在疫苗接種人群中仍有10％左右的接種者不能產(chǎn)生高滴度的保護(hù)性抗

3、體，從而導(dǎo)致疫苗接種失敗。DNA疫苗能誘生較強(qiáng)的特異性CD8<'+>T細(xì)胞應(yīng)答成為人們研究預(yù)防和治療性疫苗的熱點(diǎn)，但在大型哺乳動(dòng)物和人類中所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度相對(duì)較低。雖然臨床應(yīng)用中DNA疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫原性較弱，但是DNA疫苗的研究和開發(fā)還是具有廣闊的前景。鑒于目前的乙肝疫苗還存在免疫原性弱的問題，而且慢性乙肝的一個(gè)原因是機(jī)體的免疫應(yīng)答較弱，因此，尋找一種有效的免疫佐劑來增強(qiáng)HBsAg蛋白疫苗和乙肝病毒DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答或改

4、變免疫應(yīng)答類型是開發(fā)HBV疫苗的策略之一。 蘑菇和靈芝等在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被用于疾病的預(yù)防和治療，而且天然的靈芝和蘑菇在中國(guó)的食品和藥品領(lǐng)域也具有悠久的歷史。目前研究發(fā)現(xiàn)從不同機(jī)體如細(xì)菌，真菌，植物和其他的有機(jī)體提取的多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，可與宿主細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的選擇性受體(如dectin-1)相互作用，從而激活巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。在香菇和靈芝等的提取物中發(fā)現(xiàn)了很多活性物質(zhì)，香菇多糖

5、就是其中一種重要的生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能，通過上調(diào)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞MHC分子和協(xié)同刺激分子的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的成熟和活化從而發(fā)揮抗原遞呈功能，同時(shí)也能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞和DC分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用。多糖和寡糖抗炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病方面也有很多的報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗炎作用，可抑制炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子表達(dá)等，并且能夠保護(hù)機(jī)體免受免疫反應(yīng)產(chǎn)

6、生的損傷。鑒于多糖和寡糖的廣泛生物學(xué)功能和免疫調(diào)節(jié)作用，其在藥物設(shè)計(jì)和疫苗研究方面得以深入研究，發(fā)現(xiàn)多糖結(jié)合疫苗以及多糖佐劑具有良好的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答效果，多糖增強(qiáng)乙肝病毒DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)以及增強(qiáng)結(jié)核疫苗抗結(jié)核分支桿菌感染的作用。大部分多糖是一種非T細(xì)胞依賴的抗原，誘導(dǎo)不依賴T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，目前發(fā)現(xiàn)兩性多糖也可通過T細(xì)胞依賴的方式誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，因此多糖或寡糖是一個(gè)良好的藥物和疫苗佐劑的候選者。 目前報(bào)道發(fā)現(xiàn)香菇多糖發(fā)揮

7、抗腫瘤活性與其結(jié)構(gòu)和分子量相關(guān)，香菇多糖主鏈形成三螺旋構(gòu)象對(duì)于其發(fā)揮生物學(xué)功能具有重要的作用，以β-(1→6)連接為主鏈，β-(1→3)連接為側(cè)鏈的β寡糖是香菇多糖的基本結(jié)構(gòu)單位之一，被認(rèn)為是香菇多糖發(fā)揮抗腫瘤作用的重要結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人工合成的以β-(1→6)連接為側(cè)鏈，β-(1→3)連接為主鏈的β寡糖及其主鏈含有僅α-(1→3)連接的β寡糖類似物和天然提取的香菇多糖具有相似的抗腫瘤作用，能夠促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖和腫瘤壞死因子(TNF-α

8、)的分泌。由于目前應(yīng)用的大部分多糖都是植物或動(dòng)物以及其他物種的提取物，存在結(jié)構(gòu)不確定性，純度不高以及產(chǎn)量較少的問題，而且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)合成的多糖基本結(jié)構(gòu)單位和多糖具有相似的生物學(xué)效應(yīng)，而且人工合成的寡糖具有結(jié)構(gòu)明確，純度高以及產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，因此人們基于這些多糖的基本結(jié)構(gòu)單位人工合成寡糖并觀察其生物學(xué)功能。在本實(shí)驗(yàn)中，顧建新教授課題組基于香菇多糖和其他p多糖的基本結(jié)構(gòu)，人工合成了主鏈包含有一個(gè)α-(1→3)連接的，以β-(1→6)連接為側(cè)鏈，β

9、-(1→3)連接為主鏈的六聚體β寡糖，我們通過體外實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能的影響以及對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察寡糖對(duì)乙肝病毒表面抗原蛋白疫苗以及核心抗原DNA疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的佐劑效應(yīng)。 第一章人工合寡糖對(duì)骨髓來源樹突狀細(xì)胞功能的影響鑒于樹突狀細(xì)胞在天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)以骨髓來源的DC為細(xì)胞模型觀察β寡糖的免疫調(diào)節(jié)作用。分離小鼠骨髓細(xì)胞，并在細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF作用

10、下分化為樹突狀細(xì)胞(MDC)，通過體外細(xì)胞模型觀察人工合成β寡糖對(duì)DC細(xì)胞功能的影響。根據(jù)顧建新教授提供的高效液相色譜(HPLC)的數(shù)據(jù)提示β寡糖的純度為98％以上。脂多糖(LPS)ELISA檢測(cè)顯示在人工合成的β寡糖中未能檢測(cè)到LPS，而且β寡糖在實(shí)驗(yàn)使用濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞均無毒性，100μg/ml 濃度時(shí)還具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。在體外使用不同濃度的β寡糖對(duì)MDC進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)β寡糖能夠促進(jìn)MDC協(xié)同刺激分子如CD40，CD80，CD86

11、等表達(dá)，并能夠促進(jìn)MDC成熟：在100μg/ml β寡糖作用下，CD40，CD80，CD86的表達(dá)分別為 50.85％，46.19％和39.87％，而未刺激組分別為42.85％，39.78％和27.81％，在200μg/ml β寡糖作用下還能促進(jìn)MHC Ⅱ類分子表達(dá)(處理組 46.01％和未處理組42.87％)，而且CD11c<'+>CD40<'+>或CD11c<'+>CD80<'+>或CD11c<'+>CD86<'+>或CD11c<'

12、+>MHC Ⅱ<'+>細(xì)胞的數(shù)量與未處理組相比也有10％-16％不同程度的升高：并且β寡糖對(duì)HBsAg誘導(dǎo)的MDC的成熟也有促進(jìn)作用(12％-26％的升高)，但是對(duì)MDC的吞噬能力并沒有影響。成熟的DC能夠遷移到局部淋巴組織誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將β寡糖刺激后的MDC用PE-標(biāo)記的CD11c抗體染色，然后將標(biāo)記的細(xì)胞注射到小鼠右側(cè)腹部皮下，24小時(shí)后檢測(cè)遷移到淋巴結(jié)中標(biāo)記的MDC：結(jié)果顯示，右側(cè)腹股溝淋巴結(jié)中有2.07％為遷移的MD

13、C，但在其他部位的淋巴結(jié)中未能檢測(cè)到標(biāo)記的MDC。通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β寡糖對(duì)MDC分泌細(xì)胞因子IL-10的能力無明顯影響。成熟的 DC可促進(jìn)初始T淋巴細(xì)胞的增殖，通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β寡糖能促進(jìn)HBsAg誘導(dǎo)的MDC混合淋巴細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明β寡糖能夠增強(qiáng)骨髓來源DC的功能。 第二章人工合成寡糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞功能的影響由于巨噬細(xì)胞是天然免疫應(yīng)答中的重要成員，在天然免疫應(yīng)答中起著

14、重要的免疫防御和免疫自穩(wěn)作用，而且也是重要的抗原遞呈細(xì)胞，因此實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人工合成的β寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7功能的影響。通過體外用β寡糖和 RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，48h以后發(fā)現(xiàn)β寡糖可促進(jìn)RAW264．7細(xì)胞增殖，而且能促進(jìn)RAW264．7細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子CD40的表達(dá)，β寡糖處理組3×10<'4>個(gè)細(xì)胞中有8,092個(gè)細(xì)胞表達(dá)CD40，而未處理組只有6，168個(gè)細(xì)胞表達(dá)CD40分子，β寡糖能降低CD86和MHC Ⅰ類分子

15、表達(dá)，但是對(duì)其他表面分子如CD80和MHC Ⅱ類分子的表達(dá)并無影響?；罨木奘杉?xì)胞具有很強(qiáng)吞噬能力，通過中性紅實(shí)驗(yàn)以及對(duì)HRP吞噬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β寡糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264．7對(duì)中性紅和HRP的吞噬作用，未處理組細(xì)胞中性紅吞噬率為317％，而聯(lián)合使用β寡糖后的吞噬率為637％，是未處理組的2倍。β寡糖處理后的RAW264．7細(xì)胞HRP吞噬率為40．02，而未處理組則為30．71，β寡糖處理后明顯增強(qiáng)RAW264．7細(xì)胞的吞噬能力。通過檢

16、測(cè)β寡糖處理后對(duì)細(xì)胞因子TNF-α分泌的影響。 第三章人工合成寡糖對(duì)人外周血單核細(xì)胞和HT29細(xì)胞分泌IL-18及相關(guān)因子的影響IL-18是IL1細(xì)胞因子超家族中的一員，是 IFN-γ產(chǎn)生的主要誘導(dǎo)因子之一，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起著重要作用，可調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答，而且也是一種能夠在不同的免疫環(huán)境中調(diào)節(jié)Th1或Th2類免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子。 第四章人工合成寡糖對(duì)乙肝病毒表面抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的影響由于β寡糖能增強(qiáng)

17、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)β寡糖對(duì)乙肝病毒表面抗原蛋白疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的佐劑效應(yīng)。通過將β寡糖和HBsAg聯(lián)合免疫小鼠，不同時(shí)間點(diǎn)觀察β寡糖對(duì)HBsAg誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β寡糖在初次免疫后第6天和第35天可增強(qiáng)HBsAg免疫后小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的募集，在第6天HBsAg免疫后小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞數(shù)量是PBS組的5倍，在第35天則達(dá)到8倍左右，而聯(lián)合β寡糖免疫在第6天和第35天分別是PBS組