人全基因組乙型肝炎病毒基因（亞）型間重組體研究.pdf

1、人乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）正嗜肝DNA病毒屬(Orthohepadnavirus)的代表種，是目前已知的最小人類DNA病毒。不同毒株間發(fā)生重組是HBV病毒多樣化的一個(gè)重要來源，可能引起病毒生物學(xué)特性及毒性改變甚至宿主范圍的擴(kuò)大，給乙型肝炎的基礎(chǔ)研究和臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。本研究主要通過分析目前世界范圍內(nèi)公共數(shù)據(jù)庫中海量HBV全基因組數(shù)據(jù)資源，得到各種可能的

2、基因（亞）型重組體，并統(tǒng)一用“親本骨架序列基因型（大寫）/親本插入序列基因型（小寫）”的方式表示各重組型（如B/c、D/a及C/a等）;總結(jié)詳細(xì)重組信息，包括熱點(diǎn)和惰性重組區(qū)域、不同基因型的重組特點(diǎn)和重組傾向等;根據(jù)目前已知毒株流行趨勢，在HBV重組研究領(lǐng)域首次提出用流行重組模式和散發(fā)重組模式描述各重組類型病毒株;首次全面分析各重組類型親本骨架序列與親本插入序列的基因亞型組成，在此基礎(chǔ)上嘗試分析在亞洲地區(qū)普遍流行的B/c型重組毒株可能的

3、進(jìn)化歷程。主要研究內(nèi)容如下:
　　從GenBank上下載截至2010年10月的全部人HBV全長基因組數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)一化處理，獲得用于分析的基因組長度在3082-3384bp之間的3560條HBV全基因組序列，利用Access2007構(gòu)建本地微型數(shù)據(jù)庫Seq-HBV。
　　建立基因亞型雙代表結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分型方法對全部3560條全長序列基因（亞）型精確分型。HBV分型結(jié)果表明:能夠確定（亞）型有3450條，分別屬于基因（亞）型A

4、1-A7，B1-B8，C1-C10，D1-D8、E、F1-F4，G、H，I1-12和J;能夠明確基因型卻不能確定亞型的有110條，分別屬于A、B、C及D基因型。所有基因型中，C基因型序列數(shù)最多，所占比例達(dá)到37.1％;其次是B基因型占22.9％;其他依次是D基因型占14.6％，A基因型占13％，F(xiàn)基因型占2.3％，I基因型占1％，H和G基因型均占0.8％，最少的是J基因型，目前只發(fā)現(xiàn)一條序列。C基因型最主要亞型是C1和C2，C2亞型占到

5、C型總序列數(shù)的81.2％，C1亞型占12.5％;B基因型中，B2和B1亞型分別占總B型的76.5％和4.8％;D基因型主要亞型是D1、D2及D3，毒株數(shù)分別占總D型的44.2％、22％及17.7％;A基因型中，A2和A1亞型分別占A型總序列數(shù)的51.7％和32.8％。在此基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了每個(gè)基因型及主要亞型的共有序列(Concensus sequence)作為判斷基因（亞）型的參考序列。各基因（亞）型均具有一定的地理區(qū)域分布，同一地區(qū)存在

6、多種基因型混合流行趨勢。
　　以大量數(shù)據(jù)分析為依據(jù)，嚴(yán)格挑選的78條雙代表序列可以作為HBV基因（亞）型分型的參考序列;闡述重組毒株群與基因亞型的關(guān)系，優(yōu)化HBV基因（亞）型分類標(biāo)準(zhǔn)，提出了確定HBV基因（亞）型的七個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)。
　　根據(jù)HBV毒株基因組小且為環(huán)狀特點(diǎn)，建立了步移區(qū)段基因型法(Stepping fragment-genotyping method)大規(guī)模搜索可能具有鑲嵌結(jié)構(gòu)的HBV毒株基因組。將搜索到的所有鑲

7、嵌結(jié)構(gòu)基因組利用SimPlot軟件掃描分析模式和序列相似性分析模式共同分析重組和定位重組位點(diǎn)。集中同一重組事件的疑似重組株、親本序列、參考序列（基因型/亞型共有序列和各基因型/亞型代表序列）及外圍序列對重組區(qū)域和全長序列分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。比較兩系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)，如果一個(gè)疑似重組病毒株在全基因組序列上與親本骨架序列聚類成枝，而在重組區(qū)域與另一基因（亞）型序列聚類，且自展值(Bootstrap value)在70％以上，本研究鑒定為重組病毒

8、株。
　　最后，從人HBV全基因組中分析出17種雜交型共61種重組類型的915例基因型間重組病毒株，其中新發(fā)現(xiàn)2種雜交型（B/i和D/c）、22種重組類型及648株基因型間重組病毒株。首次在同一基因型內(nèi)分析重組體，共得到5種雜交型的5例基因型內(nèi)重組病毒株。
　　重組病毒株組成與分布。918例HBV重組株分屬于各基因型:A基因型（30例）、B基因型（743例）、C基因型（73例）、D基因型(58例)、E基因型（3例）、F基因型

9、（1例）及G基因型（5例）。新發(fā)現(xiàn)的22種重組類型包括B/c（6種）、C/b（7種）、C/d和D/a各兩種，以及B/i、C/a、 D/c、D/e和A/d各一種。對已經(jīng)報(bào)道和新發(fā)現(xiàn)的所有重組類型詳細(xì)分析其親本骨架序列及親本插入序列的基因亞型組成，嘗試尋找HBV基因型及重組型遺傳進(jìn)化線索。同一基因型內(nèi)五種重組類型包括:C1/c2（2種）、D5/d1（2種）和D5/d3(1種)，均來自亞洲地區(qū)。一般而言，重組型兩親本基因（亞）型都是當(dāng)?shù)氐牧餍?/p>

10、或存在的基因（亞）型: B/c主要在亞洲特別是東南亞流行;A/d主要印度流行;C/d主要在中國西部及外蒙古流行;D/e主要在非洲流行;G/a主要在歐洲流行。
　　重組模式。以現(xiàn)有數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，根據(jù)不同重組類型毒株流行趨勢，首次嘗試用流行重組模式（Circulating recombinant form，CRF）與散發(fā)重組模式（Sporadic recombinant form，SRF）描述不同HBV重組毒株的重組類型。如果毒株序列群

11、有相同的重組類型且來自不同的國家或地區(qū)，說明此重組類型在HBV自然進(jìn)化過程中已經(jīng)保存下來，有進(jìn)一步流行傳播的趨勢，我們歸類為流行重組模式;如果一條或幾條序列有自身特定的重組類型并來自同一標(biāo)本，這類重組類型是零散發(fā)生的，可能在進(jìn)化過程中被選擇或被淘汰，暫不確定其傳播性，我們歸類為散發(fā)重組模式。本研究將全部61種基因型間重組類型歸為7個(gè)流行重組模式，6個(gè)潛在流行重組模式和48種散發(fā)重組模式。對屬于流行重組模式的重組株，可以著手從基礎(chǔ)和臨床開

12、展全面研究，而對于屬于散發(fā)重組模式的毒株，可以依托Genebank免費(fèi)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)科研機(jī)構(gòu)建立跟蹤監(jiān)測報(bào)告體系。
　　重組傾向。A、B、C、D、E及G是比較活躍的基因型，都可以作為重組親本骨架序列或親本插入序列參與重組?；蛐虰與C、A與D、C與D、A與E、E與D、G與C及G與A之間都可以兩兩頻繁發(fā)生重組，但是僅一種雜交型有形成穩(wěn)定遺傳毒株的趨勢，如B/c、A/d、C/d、A/e、D/e、C/g及G/a等;B與D、B與E及C與

13、E基因型間暫未發(fā)現(xiàn)重組株。A和C基因型更容易作為親本插入序列與其他基因型發(fā)生重組形成D/a、E/a、B/a、C/a、D/a、G/a及B/c、D/c、G/c、F/c等重組類型;G基因型絕對毒株數(shù)量雖少卻頻繁參與重組，是值得關(guān)注的推動HBV進(jìn)化的基因型。H基因型具有重組惰性，既不與參與其他基因型的重組，自身也不接受其他基因組的插入重組。
　　重組熱點(diǎn)與惰性區(qū)域。重組頻率最高的區(qū)域是S基因3'端到P基因3'端包含整個(gè)X基因區(qū)域，其次是S

14、區(qū)及C區(qū)。不同基因型以不同方式參與重組時(shí)重組發(fā)生位點(diǎn)及區(qū)域選擇有差異，重組插入的位點(diǎn)一般位于基因兩端，重組覆蓋的區(qū)域長度不一。短區(qū)域nt2500-3000附近是除C/b重組型之外罕有重組事件發(fā)生的惰性區(qū)域?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)分析表明:HBV重組發(fā)生熱點(diǎn)區(qū)域并非是形成穩(wěn)定遺傳毒株的主要區(qū)域。
　　本研究主要分析目前世界范圍內(nèi)公共數(shù)據(jù)庫中所有HBV基因（亞）型重組體，總結(jié)重組型的詳細(xì)重組信息，為進(jìn)一步探索HBV重組規(guī)律及基因（亞）型、重組型遺傳