TOM復(fù)合體和DNA聚合酶γ的線粒體運(yùn)輸在早衰邊緣細(xì)胞模型中的作用與機(jī)制.pdf

1、第一部分建立大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞mtDNA4834bp缺失突變早衰模型
　　目的:用大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞建立線粒體 DNA4834bp缺失突變早衰模型,為進(jìn)一步研究mtDNA4834bp缺失突變在年齡相關(guān)性聽力損失中的作用機(jī)制提供易獲取的研究對象。
　　方法:選取出生3天左右的大鼠,顯微鏡下解剖后分離耳蝸血管紋,消化法接種細(xì)胞。經(jīng)多次純化后獲取比較均一的血管紋邊緣細(xì)胞,CK-18的免疫熒光化學(xué)方法鑒定。細(xì)胞經(jīng)不同濃度梯度

2、(0,2,4,6,8,10,12,14,16g/l)的D-半乳糖和D-甘露醇滲透壓組處理3,7天和11天后,采用CCK-8檢測不同濃度D-半乳糖對細(xì)胞活力的影響。濃度梯度D-半乳糖處理不同時(shí)間(3天和7天)和12g/lD-半乳糖處理細(xì)胞不同天數(shù)(1,3,5,7,9,11,13,15天)后,Taqman探針實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)的濃度和時(shí)間依賴性的mtDNA4834bp缺失突變率的累積。細(xì)胞經(jīng)12g/lD-半乳糖處理不

3、同天數(shù)(1,5,11天)后,采用β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老的程度。12g/l D-半乳糖處理細(xì)胞1天和15天后,行TUNEL原位顯色法檢測邊緣細(xì)胞的凋亡狀況。
　　結(jié)果:細(xì)胞經(jīng)CK-18的免疫熒光染色后,胞漿呈現(xiàn)較強(qiáng)特異性熒光。邊緣細(xì)胞經(jīng)濃度梯度D-半乳糖和滲透壓匹配的D-甘露醇處理后,細(xì)胞活力變化在D-半乳糖組和滲透壓對照組之間無顯著差異,14g/l和16g/l時(shí)細(xì)胞活力呈現(xiàn)濃度依賴性下降,以此為依據(jù)選取12g/l作為后續(xù)處

4、理細(xì)胞的最佳濃度。D-半乳糖能誘導(dǎo)邊緣細(xì)胞出現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性的mtDNA4834bp缺失突變的累積,在處理5,7,9,11天時(shí),與對照組相比有顯著差異。β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示,與對照組相比D-半乳糖組藍(lán)染細(xì)胞呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的增多,表示細(xì)胞的明顯衰老。細(xì)胞經(jīng)長時(shí)間的D-半乳糖處理后,TUNEL染色結(jié)果顯示陽性細(xì)胞較對照組明顯增加。
　　結(jié)論:成功培養(yǎng)了原代耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞;D-半乳糖引致的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境滲透壓的變化是導(dǎo)致細(xì)胞活

5、力下降的主要原因;D-半乳糖能成功誘導(dǎo)邊緣細(xì)胞出現(xiàn)mtDNA4834bp缺失突變,且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性的累積;D-半乳糖能誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)早衰的特點(diǎn);細(xì)胞經(jīng)D-半乳糖處理較長時(shí)間后才出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。故成功建立了大鼠mtDNA4834bp缺失突變細(xì)胞早衰模型。
　　第二部分線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶Tom40的功能狀態(tài)與DNA聚合酶γ的線粒體輸送改變致mtDNA4834bp缺失突變機(jī)制的研究
　　目的:探討掌管線粒體前體蛋白輸送的線粒

6、體外膜轉(zhuǎn)位酶Tom40在mtDNA4834bp缺失突變的累積過程中的功能變化,與線粒體DNA修復(fù)酶DNA聚合酶γ的線粒體輸送的關(guān)系,以揭示線粒體前體蛋白輸入的功能變化在年齡相關(guān)性聽力損失發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:取正常成年大鼠耳蝸,石蠟包埋后制成石蠟切片,行組織的免疫熒光染色技術(shù)檢測Tom40在正常大鼠耳蝸中的表達(dá)。原代培養(yǎng)的耳蝸邊緣細(xì)胞經(jīng)12g/l D-半乳糖處理11天后,行細(xì)胞的免疫熒光化學(xué)染色檢測細(xì)胞內(nèi)Tom40的表達(dá)情

7、況。邊緣細(xì)胞經(jīng)濃度梯度(0,2,4,6,8,10,12g/l)D-半乳糖處理3天和7天后,12g/l D-半乳糖處理不同時(shí)間(0,1,3,5,7,9,11天)后納入實(shí)驗(yàn),分別提取細(xì)胞總蛋白以及線粒體蛋白,經(jīng)western blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)和線粒體的Tom40,DNA聚合酶γ的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)耳蝸的組織免疫熒光染色結(jié)果顯示,Tom40在耳蝸組織中表達(dá)豐富,Corti氏器,耳蝸外側(cè)壁血管紋以及螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域均有特異性

8、表達(dá)。(2)邊緣細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果顯示,細(xì)胞含有豐富的線粒體,胞漿和胞核均有Tom40的強(qiáng)表達(dá),且經(jīng)D-半乳糖處理后,胞漿內(nèi)Tom40的表達(dá)減弱。(3)濃度梯度 D-半乳糖誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)總Tom40的表達(dá)先緩慢增加然后降低,且與處理時(shí)間無明顯關(guān)系。(4)D-半乳糖誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Tom40表現(xiàn)出時(shí)間依賴性的動態(tài)變化;線粒體的Tom40的表達(dá)則明顯增強(qiáng)。(5)細(xì)胞內(nèi)和線粒體的DNA聚合酶γ的表達(dá)呈現(xiàn)先增高再減低的趨勢,在mtDNA4834bp缺失突

9、變顯著累積時(shí)則表現(xiàn)為明顯下降。
　　結(jié)論:Tom40在大鼠內(nèi)耳血管紋區(qū)域以及原代培養(yǎng)的邊緣細(xì)胞中表達(dá)豐富,它的功能變化可能會影響到耳蝸細(xì)胞的正常功能,而導(dǎo)致疾病的發(fā)生;D-Gal誘導(dǎo)Tom40和DNA聚合酶γ的動態(tài)變化反應(yīng)了細(xì)胞對氧化應(yīng)激的代償與失代償;細(xì)胞內(nèi)Tom40和DNA聚合酶γ的D-Gal時(shí)間累積性變化趨勢吻合,表明Tom40的功能變化影響DNA聚合酶γ的線粒體輸送;細(xì)胞內(nèi)Tom40和DNA聚合酶γ的D-Gal濃度依賴性變

10、化趨勢不一致,尤其是短期誘導(dǎo)后,提示可能有其他因素參與到DNA聚合酶γ的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)過程中;線粒體的Tom40在mtDNA4834bp缺失累積的過程中,其功能增強(qiáng);相反,DNA聚合酶γ的線粒體輸送減少;細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)Tom40蛋白表達(dá)的變化趨勢不一致,提示Tom40蛋白的表達(dá)可能受到轉(zhuǎn)錄后機(jī)制的調(diào)控。
　　第三部分線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶Tom20和Tom70的功能狀態(tài)與mtDNA4834bp缺失突變機(jī)制的研究
　　目的:進(jìn)一步探討

11、掌管線粒體前體蛋白輸送的線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶的識別受體Tom20和Tom70在mtDNA4834bp缺失突變的累積過程中的功能變化,以揭示在線粒體前體蛋白輸入線粒體內(nèi)部之前,蛋白的識別功能變化在年齡相關(guān)性聽力損失發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:原代培養(yǎng)的耳蝸邊緣細(xì)胞純化后,行細(xì)胞的免疫熒光化學(xué)染色檢測細(xì)胞內(nèi)Tom20和Tom70的表達(dá)情況。邊緣細(xì)胞經(jīng)濃度梯度(0,2,4,6,8,10,12g/l)D-半乳糖處理3天和7天后,12g/l

12、D-半乳糖處理不同時(shí)間(0,1,3,5,7,9,11天)后納入實(shí)驗(yàn),分別提取細(xì)胞總蛋白以及線粒體蛋白,經(jīng)western blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)和線粒體的Tom20和Tom70的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:邊緣細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果顯示,細(xì)胞胞漿內(nèi)含有豐富的Tom70和Tom20,Tom70沿核膜分布明顯;Tom20和Tom70的D-半乳糖濃度依賴性的變化不一致,Tom70經(jīng)低濃度D-半乳糖處理后表達(dá)即升至最高,濃度梯度D-Gal誘導(dǎo)的Tom