結(jié)直腸癌電子表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析及差異表達(dá)基因研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的常見病,其發(fā)病率近年上升趨勢(shì)明顯.盡管結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制取得一定進(jìn)展,仍有許多已知或未知的基因有待于進(jìn)一步探索.隨著人類基因組計(jì)劃、單體型計(jì)劃和癌癥基因組解剖計(jì)劃等大規(guī)模測(cè)序項(xiàng)目的完成,公共數(shù)據(jù)庫(kù)積累了大量的基因組序列信息.表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequencetag,EST) 是 cDNA.單次測(cè)序結(jié)果,是尋找基因的重要方法.挖掘公共 EST 數(shù)據(jù)庫(kù)(database of EST,

2、dbEST),將為我們的研究帶來新思路.本文從 dbEST 獲取結(jié)直腸正常、炎癥性腸病、腺瘤和腺癌等相關(guān)EST,利用 dbEST和 UniGene 數(shù)據(jù)庫(kù)的序列注釋特征,開發(fā)生物信息學(xué)軟件GetUni,成功實(shí)現(xiàn)了從EST到UniGene的聚類,構(gòu)建結(jié)直腸正常(N)、炎癥性腸病(IBD)、腺瘤(A)和腺癌(T)四個(gè)電子文庫(kù),各文庫(kù)分別包含4375、3451、875和200608個(gè)UniGene,4108、2230、606和18891個(gè)非冗

3、余 UniGene,及4108、2201、592和14879個(gè)基因.美國(guó)癌癥研究所 (National Cancer Institute,NCI) 結(jié)直腸正常及癌組織cDNA文庫(kù)Xprofiler交叉驗(yàn)證GetUni的轉(zhuǎn)化效率.電子文庫(kù)間的直接比對(duì)以及基于 Gene Ontology 的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):除bA9F11.1 (Hs.329040)外,T文庫(kù)包括了N、IBD和A等3個(gè)文庫(kù)的全部基因.T文庫(kù)每個(gè)基因平均含1.27個(gè)轉(zhuǎn)錄子,

4、顯著高于其它三個(gè)文庫(kù)(p<0.01).生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)50條信號(hào)通路在文庫(kù)間富集程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p<0.01),核糖體蛋白基因與糖酵解/糖異生通路基因在文庫(kù)A和IBD相對(duì)富集,整合素信號(hào)通路基因在N和IBD相對(duì)富集,七次跨膜受體(rhodopsin family)家族則在T文庫(kù)相對(duì)富集.Q-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),RPS2、RPS12、RPS27a、RPL7a、RPL5和RPL10等6個(gè)核糖體蛋白基因分別有5例、6例、3例、5例、

5、2例和3例腺瘤表達(dá)相對(duì)正常表達(dá)增高,21例、18例、17例、14例、21例和13例結(jié)直腸癌表達(dá)相對(duì)增高.但各基因在正常、腺瘤和腺癌等不同組織之間的表達(dá)水平差異未發(fā)現(xiàn)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05).系統(tǒng)聚類把腺瘤、結(jié)直腸癌分成核糖體蛋白基因富集程度較高的A組和相對(duì)較低的B組,各有25例(腺瘤7例)和23例(腺瘤1例)結(jié)直腸腫瘤,提示腺瘸核糖體蛋白基因富集程度顯著高于結(jié)直腸癌(87.5﹪,7/8例腺瘤vs 45﹪,18/40例結(jié)直腸癌),

6、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.020). 在結(jié)直腸組織電子表達(dá)譜生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,選取95個(gè)基因構(gòu)建整合TaqMan定量PCR和微流體技術(shù)的低密度芯片(Low density array,LDA),進(jìn)行高通量定量PCR研究.這些基因大多與結(jié)直腸正常粘膜上皮分化關(guān)系密切,包括Wnt、TGFβ/BMP4、Hegehog和Notch等四條信號(hào)通路、Polycomb Group(PeG)基因家族及其它細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)基因.96個(gè)基因

7、(含GAPDH)中,僅DAAM1未見有效擴(kuò)增信號(hào).26例結(jié)直腸癌配對(duì)組織(包括27個(gè)癌、7個(gè)腺瘤及配對(duì)正常組織)LDA檢測(cè)總體陽(yáng)性率為97.2﹪(11520/11844).同一組織不同LDA GAPDH檢測(cè)Ct值之差最大為0.952,最小0.001,平均Ct值之差在0.279±0.254.Spearman相關(guān)分析和Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)兩次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果高度相關(guān)(p<0.0001,r=0.911,r<'2>=0.829).94個(gè)基因

8、在不同實(shí)驗(yàn)之間的ACt值差異,94個(gè)基因兩次實(shí)驗(yàn)間的ACt值差平均為0.3±0.33.Spearman相關(guān)分析和Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)各基因兩次實(shí)驗(yàn)間ACt差平均值與基因平均ACt值呈高度線性正相關(guān)(p4.0001,r=0.743,r<'2>=0.551).配對(duì)正常和腺癌組織之間LDA鑒定了79個(gè)差異表達(dá)基因(p<0.05),癌組織表達(dá)上調(diào)4個(gè),下調(diào)75個(gè),2倍以上34個(gè).其中,Wnt信號(hào)通路基因NKD1和SOX9在結(jié)直腸癌組織表

9、達(dá)顯著上調(diào),分別較正常上調(diào)15.15倍和1.62倍,APC、DAAM2、TCf4等基因表達(dá)顯著下調(diào),分別較正常下調(diào)2.71倍、3.81倍和2.18倍.與正常組織相比,TGFβ/BMP4信號(hào)通路基因TGFBl、SMAD4、L3MBTL,等在結(jié)直腸癌組織分別下調(diào)2.41倍、2.51倍和1.39倍,HH信號(hào)通路基因IHH、DISP1、DISP2等在結(jié)直腸癌組織分別下調(diào)2.03倍、1.79倍和13.96倍,Notch信號(hào)通路基因NOTCH2、M

10、AML1、MAL2、MAML3、HES1、HES2等基因在結(jié)直腸癌分別下調(diào)2.22倍、1.91倍、2.39倍、1.96倍、1.76倍、1.76倍,PeG基因家族EZH2在結(jié)直腸癌組織上調(diào)1.64倍,EPC1、EPC2、PCGF1、PCGF2、PCGF3、PCGF4、PCGF5、PCGF6等分別下調(diào)2.28倍、1.96倍、1.93倍、2.02倍、1.63倍、1.49倍、2.28倍和1.58倍.7例正常、腺瘤及腺癌配對(duì)組織LDA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)59

11、個(gè)差異表達(dá)基因(p4.05).在結(jié)直腸腺瘤,上述各基因的表達(dá)趨勢(shì)基本上與腺癌一致. SYBR Q-PCR檢測(cè)了19個(gè)基因在22例正常、腺癌配對(duì)結(jié)直腸組織的表達(dá),發(fā)現(xiàn)SOX9、EPC1、EPC2、CECR1、KLF9、METRNLNKDl、NJMB、SPRED2、DISP2等10個(gè)基因在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(p<4.05).全部19個(gè)基因SYBR Q-PCR.與LDA的表達(dá)趨勢(shì)(2<'△△ct>)一致.19個(gè)基

12、因的中位表達(dá)變化倍數(shù)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測(cè)結(jié)果高度相關(guān) (p=0.003,r=0.79,r<'2>=0.637).最后,我們對(duì)結(jié)直腸癌表達(dá)上調(diào)基因SOX9進(jìn)行了比較全面的臨床病理研究.20例結(jié)直腸癌及6個(gè)細(xì)胞系DNA測(cè)序未能發(fā)現(xiàn)SOX9基因編碼區(qū)存在突變.21例結(jié)直腸正常、腺癌及5個(gè)伴發(fā)腺瘤配對(duì)組織 Western-blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SOX9、β-Catenin 分別在16例和15例腺癌表達(dá)上調(diào),各有5個(gè)和2個(gè)腺瘤表達(dá)上調(diào).結(jié)直腸

13、癌SOX9、β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (Mean±SD:SOX9正常0.3293±0.3863,腺癌0.907±0.6413,p<0.01;β-catenin正常0.3397±0.2921,腺癌0.6024±0.498,p<0.05).免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),正常粘膜SOX9+細(xì)胞主要位于隱窩基底部,正常粘膜下部陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) (9.6±13.1﹪)顯著高于上部(3.1±5.9﹪)(p<0.001),與Ki67染色的分布

14、特征吻合.在結(jié)直腸腺瘤,SOX9+細(xì)胞沿隱窩彌漫分布,但腺瘤底部陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)要高于上部 (50.7﹪±25.1﹪ vs 32.9﹪±30.0﹪,p<0.001).結(jié)直腸腺瘤 SOX9+ 細(xì)胞(39.8﹪±30.9﹪) 要顯著高于瘤旁殘留黏膜 (24.9﹪±18.2﹪),結(jié)直腸癌SOX9總體表達(dá)率為 36.7﹪±30.3﹪,顯著高于正常粘膜和瘤旁殘留粘膜 (p<0.001),但與腺瘤表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05).結(jié)直腸腺瘤SOX9陽(yáng)

15、性率為74.5﹪(70/94),結(jié)直腸癌陽(yáng)性率為60.1﹪(113/188),腺瘤與癌的陽(yáng)性率顯著高于正常粘膜 (10/110,9.09﹪)(p<0.001).如把"-"和"-"定義為SOX9低表達(dá),"++"和"++"合并為高表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)SOX9高表達(dá)分別見于50例(53.2﹪)結(jié)直腸腺瘤和64例(34.0﹪)結(jié)直腸癌,正常粘膜未見有SOX9高表達(dá).結(jié)直腸腺瘤和癌組織SOX9高表達(dá)率顯著高于正常粘膜(p<0.001).SOX9高表達(dá)在

16、黏液腺癌/印戒細(xì)胞癌相對(duì)非黏液/印戒細(xì)胞癌少見(p<0.05,x<'2>檢驗(yàn)).SOX9高表達(dá)的結(jié)直腸癌五年生存率為39.5﹪(17/43),顯著低于SOX9低表達(dá)的結(jié)直腸癌69.5﹪(66/95)(p<0.01).多因素COX分析發(fā)現(xiàn),SOX9高表達(dá)是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)(p<0.05,RR=1.381,95﹪CI:1.051-1.815). 通過上述研究,本文得出以下結(jié)論: ①結(jié)直腸癌在分子水平呈高度異質(zhì)性,變

17、異性剪接在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中有重要作用,核糖體蛋白基因富集是結(jié)直腸腺瘤與炎癥性腸病等癌前病變的重要分子特征.因此,結(jié)直腸電子文庫(kù)的構(gòu)建有助于揭示結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的總體分子特征,對(duì)于加深我們對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制的理解有重要意義. ②結(jié)直腸上皮細(xì)胞分化關(guān)系密切的Wnt信號(hào)通路激活及TGFβ/BMP、HH、Notch等信號(hào)通路抑制及PcG家族表達(dá)改變?cè)诮Y(jié)直腸癌的發(fā)生過程中有重要作用,且這些信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò).