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文檔簡介
1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝臟惡性腫瘤,占全世界腫瘤發(fā)生率的第五位。我國作為乙肝大國,國民中乙型肝炎病毒攜帶率高,作為肝炎-肝硬化-肝癌這一進展鏈的終末端,肝癌的高發(fā)成為不爭的事實,從而使我國成為全世界肝癌的最高發(fā)地區(qū)之一。不可否認(rèn)的是,經(jīng)過幾十年的不斷努力,我國在肝癌的診治上取得了舉世矚目的成就。但是以手術(shù)切除為基礎(chǔ)的各種綜合治療(包括放射、化學(xué)、生物、靶向、肝移植等治療手段)依然
2、無法解決HCC總體預(yù)后不佳這一難題。隨著肝臟外科水平的進步和肝癌受者入選標(biāo)準(zhǔn)的進一步規(guī)范,肝臟移植被認(rèn)為是治療肝癌的一種理想治療手段,但是肝臟移植術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)這個瓶頸問題依然嚴(yán)重制約肝癌的治療效果。近年來,圍繞肝移植后肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移這一核心問題,有關(guān)預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)的生物學(xué)標(biāo)記的研究不斷升溫,成為重要的研究方向。
隨著對腫瘤轉(zhuǎn)移認(rèn)識的不斷深入和人類基因組學(xué)的長足發(fā)展,人們已經(jīng)意識到肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及到多基因改變、調(diào)控
3、的復(fù)雜過程,基于惡性腫瘤基因改變、調(diào)控的相關(guān)研究成為熱點。而作為新興的表觀遺傳學(xué)最重要的研究內(nèi)容,DNA甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活,進而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展這一問題也成為研究者關(guān)注的焦點。然而,通過文獻回顧發(fā)現(xiàn),目前有關(guān)新腫瘤抑制基因PCDH10以及基于多個腫瘤抑制基因同時甲基化的分子表型——CpG島甲基化表型(CpG islands methylator phenotype CIMP)在肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測中的價值國內(nèi)外尚無報道,因此我
4、們此前研究的基礎(chǔ)上,首次嘗試建立一個能反映肝癌生物學(xué)特征的CpG島甲基化表型,探討其在肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測中的價值;并以新型TSG-PCDH10作為研究對象,系統(tǒng)研究作為優(yōu)化的CIMP的候選TSG在肝細(xì)胞肝癌進展中的作用及其調(diào)控機制,以期建立一個與復(fù)發(fā)密切相關(guān)的CIMP模型,為進一步提高肝癌肝移植的早期復(fù)發(fā)預(yù)測能力,建立肝癌肝移植“中國標(biāo)準(zhǔn)”提供候選的新的腫瘤生物學(xué)參數(shù)。
第一部分:腫瘤抑制基因的DNA甲基化及相關(guān)CpG島
5、甲基化表型對肝移植后肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測的價值研究
目的:
基因啟動子區(qū)甲基化是最重要的表觀遺傳修飾,通過結(jié)合甲基化結(jié)合域(MBD)和組蛋白乙?;芤鸹虻谋磉_沉默,尤其是抑癌基因啟動子區(qū)的甲基化在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮了非常重要的作用。肝癌中多個基因啟動子區(qū)的協(xié)同甲基化所形成的CpG島的甲基化表型被證實與肝癌病理,如甲胎蛋白的升高有密切關(guān)系。本實驗通過檢測肝癌中多基因啟動子區(qū)的甲基化,觀察腫瘤相關(guān)基因甲基
6、化在肝癌中的發(fā)生情況,建立與肝移植肝癌復(fù)發(fā)預(yù)后相關(guān)CpG島甲基化表型,并分析CpG島甲基化表型與臨床病理指標(biāo)之間的聯(lián)系。
方法:
選取P16, CDH1, GSTP1, DAPK, MGMT, XAF1, TIMP3, SOCS1, SFRP1, TMS1, SYK, DKK1共12個腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域CpG島上甲基化位點(上述基因已知可能與人類不同惡性腫瘤,特別是消化道腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移乃至預(yù)后相關(guān)
7、),應(yīng)用甲基化特異性PCR(MethylaTiO2-Specific PCR)首先對小規(guī)模20例HCC肝移植病人的病肝組織DNA進行甲基化狀況的初篩,將其中甲基化頻率高于40%的7個腫瘤抑制基因(P16, CDH1, GSTP1, DAPK, XAF1, SOCS1, SYK)作為CpG島甲基化表型的標(biāo)志基因,并將上述位點的甲基化檢測擴大到65例HCC肝移植病人的病肝組織DNA樣本,然后根據(jù)甲基化狀況的不同對65例病人進行CpG島的甲基
8、化表型(CIMP)分類;另一方面對肝癌肝移植病人進行臨床病理資料的收集,對病人進行隨訪,比較不同CpG島甲基化表型與病人臨床病理指標(biāo)及移植術(shù)后的3年無復(fù)發(fā)生存之間的關(guān)系。
結(jié)果:
所檢測的臨床樣本中12個基因的甲基化頻率各不相同:從MGMT的5%到XAF1的66%不等;所選擇的7個CpG島甲基化表型的標(biāo)志基因中,存在協(xié)同甲基化現(xiàn)象,即P16與SYK同時甲基化(P=0.001),P16與CDH1同時甲基化(P=
9、0.008),CDH1與DAPK同時甲基化(P=0.003)。在分析了單個腫瘤抑制基因與臨床病理學(xué)指標(biāo)及預(yù)后信息后發(fā)現(xiàn):GSTP1的高甲基化與低組織學(xué)分級(P=0.003)和多發(fā)的腫瘤個數(shù)有關(guān)(P=0.011);XAF1的高甲基化與病人術(shù)前AFP水平存在相關(guān)性(P=0.007),此外DAPK的甲基化狀況與腫瘤的大小也存在一定的聯(lián)系(P=0.016),但其他單個基因的甲基化狀況與病人的臨床病理學(xué)指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異,并且所有單個基因的甲基化
10、狀況與病人的復(fù)發(fā)預(yù)后也無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。應(yīng)用Log-rank檢驗,分析甲基化數(shù)目與復(fù)發(fā)生存的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在所選擇的7個抑癌基因中,大于等于3個基因發(fā)生甲基化與肝移植后肝癌復(fù)發(fā)具有最顯著的相關(guān)性(P=0.004),因而將CpG島的甲基化表型(CIMP)分類為CIMP陽性(甲基化數(shù)目大于等于3個)和CIMP陰性(甲基化數(shù)目小于3個)。隨后的分析發(fā)現(xiàn),CpG島的甲基化表型狀態(tài)與術(shù)前AFP水平和腫瘤大小存在相關(guān)性(P值分別為0.0
11、17和0.007),但與病人的其它臨床病理學(xué)指標(biāo)如性別、年齡、是否合并門靜脈癌栓(PVTT)、組織學(xué)分級、腫瘤大小均無關(guān)(P>0.05)。同時,結(jié)合我們中心之前提出的肝移植杭州標(biāo)準(zhǔn),證實超越杭州標(biāo)準(zhǔn)的病人比符合杭州標(biāo)準(zhǔn)的病人具有更高的CIMP陽性發(fā)生率(84% vs.57%,P=0.017)。之后我們運用Kaplan-Meier生存曲線分析CpG島的甲基化表型與肝癌肝移植病人生存期關(guān)系時發(fā)現(xiàn)CpG島的甲基化表型陽性組(CIMP+)的病人
12、的移植后三年無復(fù)發(fā)生存期比CpG島的甲基化表型陰性組(CIMP-)病人要短,且具有顯著性差異(15.3月vs.30.3月,P=0.004)。Cox單因素分析結(jié)果顯示:除了術(shù)前AFP水平、腫瘤大小以外,CpG島的甲基化表型狀態(tài)也與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。多因素分析結(jié)果表明:除腫瘤大小外,CpG島的甲基化表型狀態(tài)(危險系數(shù):3.581;95%可信區(qū)間:(1.473-8.710); P=0.005)也是影響復(fù)發(fā)的一個獨立的危險因素。
結(jié)論
13、:
CpG島的甲基化表型是影響移植后肝癌復(fù)發(fā)的獨立危險因素,對移植后肝癌復(fù)發(fā)的預(yù)測具有潛在的重要價值。
第二部分:新腫瘤抑制基因PCDH10在肝細(xì)胞肝癌中的實驗研究
目的:
原鈣粘蛋白10(PCDH10),是新近發(fā)現(xiàn)的鈣粘蛋白超家族的一名成員蛋白。早期關(guān)于PCDH10的研究主要集中在神經(jīng)生理方面,認(rèn)為PCDH10蛋白在大腦發(fā)育,特別是紋狀體軸突延伸和丘腦皮質(zhì)投射的形成中發(fā)揮了重要作
14、用。最近有研究表明,在鼻咽癌,白血病,宮頸癌,乳腺癌和胃癌等多種腫瘤細(xì)胞株和組織中存在由于PCDH10基因啟動子的異常甲基化而導(dǎo)致表達缺失現(xiàn)象,而通過外源性的過度表達PCDH10蛋白能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在宮頸癌的研究中則認(rèn)為PCDH10的甲基化可以作為宮頸癌特異性診斷的一個潛在的標(biāo)志物。而在胃癌的最新臨床研究中不僅證實PCDH10是一個典型的腫瘤抑制基因,而且PCDH10的高甲基化和病人不良預(yù)后
15、有著密切的聯(lián)系。但PCDH10在肝癌中的臨床和基礎(chǔ)研究目前尚未報道,PCDH10蛋白在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能也還不得而知。
方法:
采用Western blotting和免疫組化的方法檢測PCDH10在HCC患者腫瘤組織,癌旁以及正常肝臟組織中蛋白表達情況。用RT-PCR方法檢測去甲基化藥物(5’-Aza-dC)用藥前后肝癌細(xì)胞株中PCDH10的mRNA表達水平,研究其表觀遺傳的調(diào)控機制,同時采用甲基化特異性
16、PCR(MSP)和重亞硫酸鹽修飾測序PCR(BSP)的方法驗證目的基因的甲基化變化情況,并分析65例肝癌肝移植患者的PCDH10的甲基化狀況與臨床病理指標(biāo)及復(fù)發(fā)預(yù)后的相關(guān)性;應(yīng)用RNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),分別模擬PCDH10缺失和過表達兩種情況,進而從正反兩方面來研究PCDH10蛋白對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和克隆形成能力的影響。
結(jié)果:
在我們所選的5種不同肝癌細(xì)胞株中,80%肝癌細(xì)胞株存在PCDH10mR
17、NA表達水平的降低或缺失,而PCDH10基因的啟動子區(qū)域的高甲基化則是引起基因表達缺失的主要原因。臨床組織標(biāo)本中則發(fā)現(xiàn)DNA甲基化導(dǎo)致的PCDH10蛋白表達缺失具有腫瘤特異性,即肝癌組織中的表達相對于癌旁組織和正常組織普遍降低,并且發(fā)現(xiàn)PCDH10基因高甲基化的肝癌肝移植病人更容易發(fā)生術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā),且預(yù)后不良。體外實驗則發(fā)現(xiàn),PCDH10的過度表達能夠抑制肝癌細(xì)胞株的增殖,降低細(xì)胞的侵襲和克隆形成能力,并誘導(dǎo)凋亡。
結(jié)論
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