P190蛋白胞外disc結構域的體外表達純化及其互作蛋白的篩選鑒定.pdf

1、P190蛋白是一種單次跨膜糖蛋白，由1384個氨基酸組成，分子量約為190KD。P190大多表達于脊椎動物腦內，主要存在于中樞及外周神經的有髓神經纖維郎飛結結旁區(qū)的軸膜上，其在卵巢、胰臟、腸、肺、心臟及睪丸等組織內也有少量表達。對P190氨基酸序列的分析表明，P190胞外的區(qū)域較長（共計1264個氨基酸），含有1個FactorⅧ/discoidin(disc)結構域，2個重復的表皮生長因子結構域，4個層粘連蛋白G結構域，1個纖維蛋白原類

2、似結構域，以及1個脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸重復序列結構域；P190蛋白的細胞內區(qū)域很短（共計80個氨基酸），含有band4.1蛋白的結合結構域及富含脯氨酸的結構域。研究表明，P190的主要功能是與contactin蛋白形成復合物，富集在神經細胞軸突結旁區(qū)細胞膜上，與NF155等結合，在朗飛結的兩側形成一系列胞質環(huán)。此連接區(qū)能使髓鞘錨定于軸突，從而有助于髓鞘的絕緣和神經沖動的有效傳遞。有研究顯示，小鼠中若缺乏P190可引起結旁軸突與膠質細胞

3、相互作用的喪失及神經傳導速度的減慢；P190的異常表達可產生嚴重的神經系統(tǒng)功能紊亂，P190敲除小鼠不僅神經沖動傳導速度明顯低于野生型小鼠，而且在出生后不久就會因神經元變性壞死而死亡。另有文獻報道，P190表達降低可導致神經纖維脫髓鞘病變，加速軸突的變性壞死。
　　 本實驗室首次在人腦微血管內皮細胞(Human brain microvascular endothelialcells，HBMEC)中檢測到了P190蛋白的表達，進

4、一步的研究結果提示P190可能作為受體參與調控HBMEC緊密連接的裝配，但其涉及的機制尚不清楚。因此，為了進一步探討P190在HBMEC中的功能及其涉及的機制，本研究利用原核表達體系，對P190胞外段的disc結構域進行了體外表達及純化；并利用酵母雙雜交技術，在人胎腦cDNA文庫中篩選能夠與P190胞外段的disc結構域發(fā)生相互作用的蛋白并進行進一步驗證，以期為P190的功能研究及其涉及的分子機制積累科學資料。
　　 方法：

5、r>　　 1、PCR擴增P190胞外段disc結構域編碼基因，利用重組DNA技術構建原核表達載體；
　　 2、將原核表達重組質粒轉化至大腸桿菌BL21，以IPTG進行誘導表達，并對誘導表達條件進行優(yōu)化，SDS-PAGE分析蛋白表達情況，利用親和層析方法對表達蛋白進行純化；
　　 3、以P190胞外段disc結構域作為誘餌蛋白，利用重組DNA技術構建酵母質粒pGBKT7-P190disc，轉化入AH109酵母細胞，利用酵

6、母雙雜交技術在人胎腦cDNA文庫中篩選與P190disc結構域相互作用的蛋白；
　　 4、分析酵母雙雜交的結果，選擇感興趣的目的蛋白，進一步驗證P190胞外段disc結構域與該目的蛋白的相互作用。
　　 結果：
　　 1、獲得了P190disc結構域的編碼基因，構建了用于原核表達的重組質粒pGEX-4T-3-P190disc;
　　 2、在大腸桿菌BL21中誘導表達了GST融合的P190disc蛋白，并利

7、用親和層析方法純化得到了GST融合的P190disc蛋白；
　　 3、利用酵母雙雜交方法在人胎腦cDNA文庫中篩選出14個與P190disc結構域結合的陽性克?。?br>　　 4、選擇CD24作為目的蛋白，在酵母體內證實了P190disc結構域與CD24的相互作用；
　　 5、以293T細胞作為模式細胞，利用免疫熒光共定位技術發(fā)現CD24與P190disc結構域有明顯的共定位；
　　 6、RT-PCR方法證實C