甲（A）型流感病毒多基因表達(dá)DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效果研究.pdf

1、流行性感冒病毒(influenza virus，簡稱流感病毒)是流行性感冒(influenza，簡稱流感)的病原體。流感一直是引起人類死亡的主要疾病之一，20世紀(jì)發(fā)生的4次全球性流感大流行給個(gè)人和社會(huì)造成無法估量的損失。而從1997年至今禽流感的肆虐更給人們敲醒了警鐘。流感病毒易突變，雖然目前科學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)，人類至今無法征服流感。高效及安全的疫苗接種是預(yù)防流感的有效手段。核酸疫苗作為第三代疫苗，與傳統(tǒng)的滅活及減毒疫苗相比，其操作簡單、

2、安全有效、可大規(guī)模生產(chǎn)并能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫，使之成為流感疫苗研究的熱點(diǎn)。 血凝素(haemmagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是存在于流感病毒表面的兩種主要糖蛋白。HA可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是最主要的保護(hù)性抗體。與HA相比，NA的變異程度小，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，在抑制病毒的感染中發(fā)揮著重要作用。目前廣泛應(yīng)用的流感滅活疫苗主要由純化的流感病毒表面糖蛋白HA和NA構(gòu)成，目的

3、在于誘導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生抗-HA和抗-NA抗體。有研究表明，編碼HA或NA的核酸疫苗通過基因槍或肌肉注射可誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，提供抗流感保護(hù)作用。陳則等用表達(dá)流感病毒的HA、NA、MI、NP、NSl基因的DNA疫苗分別免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有免疫表達(dá)HA或NA的基因疫苗能夠抵抗致死量流感病毒的攻擊。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，將HA和NA DNA疫苗混合免疫小鼠能夠增強(qiáng)小鼠抵抗病毒攻擊的能力且抑制病毒在肺中的復(fù)制。進(jìn)一步研究表明NA DNA疫苗免疫的

4、動(dòng)物能夠抵抗同一亞型不同病毒株的攻擊而且在同一種屬不同種群個(gè)體間產(chǎn)生交叉免疫，HA DNA疫苗則有一定的種群局限性。因此，有學(xué)者建議：HA DNA和NA DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用。 本研究在本室成功構(gòu)建甲(A)型流感病毒A／PR／8／34(H1N1)的pcDNA3.1(+)／HA<,1>的基礎(chǔ)上，構(gòu)建pcDNA3.1(+)／HA和pcDNA3.1(+)／2qA核酸疫苗并在細(xì)胞和機(jī)體水平上研究其單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合應(yīng)用的表達(dá)及免疫效果。多個(gè)攜

5、帶不同基因的獨(dú)立載體系統(tǒng)同時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，優(yōu)點(diǎn)是可以自由調(diào)節(jié)各表達(dá)載體的比例，但缺點(diǎn)是效率太低。低效的基因轉(zhuǎn)移過程是基因治療的瓶頸。構(gòu)建多基因表達(dá)載體可提高轉(zhuǎn)移及表達(dá)效率。本課題還對(duì)多基因表達(dá)載體plRES2-EGFP進(jìn)行改造，使其共表達(dá)HA和NA或HA<,1>和NA兩種蛋白，擬提高核酸疫苗轉(zhuǎn)移及表達(dá)效率，更好的發(fā)揮核酸疫苗的免疫效果。 方法： 1．甲(A)型流感病毒單基因真核表達(dá)DNA疫苗和多基因表達(dá)DNA疫苗的構(gòu)

6、建： 利用RT-PCR．技術(shù)從流感病毒株A／PR／8／34(H1N1)感染的雞胚尿囊液中擴(kuò)增HA、NA基因，克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)／HA和pcDNA3．1(+)／NA。通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)改造真核表達(dá)載體plRES2-EGFP，構(gòu)建多基因表達(dá)載體pHA-IRES2-NA和pHA<,l>-IRES2-NA。 2．重組DNA疫苗的表達(dá)： 重組DNA疫苗用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染H

7、EK293細(xì)胞，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)情況。用G418篩選轉(zhuǎn)染后的抗性細(xì)胞，擴(kuò)增幾代后借RT-PCR技術(shù)和序列分析對(duì)目的基因進(jìn)行鑒定。重組疫苗經(jīng)肌肉注射免疫動(dòng)物，免疫組化技術(shù)檢測(cè)目的基因在肌細(xì)胞的表達(dá)及持續(xù)時(shí)間。加強(qiáng)免疫后一周，取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重要器官或組織制備組織切片，利用免疫組化技術(shù)初步了解目的蛋白從肌細(xì)胞向外分泌后，在機(jī)體其他組織器官表達(dá)的情況。 3．重組DNA疫苗的免疫效果研究： 將重組DNA疫苗肌肉注射免疫動(dòng)物，利

8、用傳統(tǒng)的病毒學(xué)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和現(xiàn)代流式細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合，研究其誘導(dǎo)機(jī)體的抗病毒效應(yīng)及對(duì)機(jī)體體液和細(xì)胞免疫的影響，探討重組DNA疫苗的免疫效果。 結(jié)果： 1．經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、RCR擴(kuò)增及序列測(cè)定證實(shí)甲(A)流感病毒單基因真核表達(dá)載體和多基因表達(dá)載體構(gòu)建成功。 2．免疫熒光組化技術(shù)顯示所構(gòu)建的單基因真核表達(dá)載體和多基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的部分細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉注射重組DNA疫苗后，目的蛋

9、白在肌肉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)可持續(xù)一段時(shí)間，所有重組質(zhì)粒除4小時(shí)無表達(dá)或表達(dá)較弱外，其他時(shí)間點(diǎn)都可觀測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。于加強(qiáng)免疫后一周，免疫組化技術(shù)檢測(cè)到目的蛋白可在肌肉、肺、腦等組織表達(dá)。 3．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒皆可誘導(dǎo)CD8細(xì)胞數(shù)量百分比的增加，都在50％以上，遠(yuǎn)高于PBS對(duì)照組(31.77％±2.99)。同時(shí)，重組質(zhì)粒上調(diào)Thl和Th2細(xì)胞的比例(>0.8)，而PBS對(duì)照組低于0.5；再次免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)(1:20以上)，是

10、初次免疫應(yīng)答(1:10以下)的2～3倍；被重組質(zhì)粒免疫的動(dòng)物可抵抗致死量的病毒攻擊，保護(hù)率在60％以上。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建了甲(A)流感病毒單基因真核表達(dá)載體和多基因表達(dá)載體。 2．經(jīng)免疫熒光技術(shù)及RT-PCR技術(shù)等證實(shí)了重組DNA疫苗能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中正確表達(dá)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉注射重組DNA疫苗后可在肌細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到目的基因表達(dá)。肌細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白可向周圍分泌，轉(zhuǎn)運(yùn)至其他組織。 3．重組DNA