通心絡改善慢性缺氧誘導的血管內皮細胞的損害及其作用機制.pdf

1、目的:血管內皮細胞間的緊密連接是決定內皮細胞間滲出的最主要結構，這些結構由排列在胞膜和胞漿的跨膜蛋白家族(occludin和claudin)、膜周蛋白家族（ZO蛋白）等構成，起著選擇性通透和維持細胞極性、內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。慢性缺氧是一種常見的導致血管內皮損傷的病理因素，可通過損傷破壞內皮結構和功能引發(fā)多種心血管疾病。所以積極改善缺氧導致的血管內皮功能受損對防治心血管疾病有重要意義。
　　通心絡(Tongxinluo，TXL)為純中

2、藥制劑，在臨床上廣泛應用于治療心腦血管病，能有效改善穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)作。最近研究發(fā)現，通心絡能夠明顯抑制缺氧條件下內皮細胞caspase-3活性的增高并減少缺氧引起的內皮細胞凋亡;通心絡可通過PI-3K/Akt/HIF信號通路上調內皮HIF表達提高血管內皮細胞對缺氧的耐受性。本研究一方面從整體水平觀察慢性缺氧對小鼠血管內皮細胞的影響及通心絡的改善作用;另一方面在細胞水平上探討通心絡改善缺氧誘導內皮細胞損害的作用機制，為心血管疾病的防治提

3、供一個新的靶點。
　　方法:C57BL/6J小鼠隨機分為對照組，缺氧組和通心絡預孵育組，缺氧組和通心絡預孵育組置于自制低壓氧艙內，每天6小時，共28天。對照組每天灌生理鹽水，通心絡預孵育組按7.5mg/10g體重每天給予通心絡超微粉混懸液灌胃。28天后檢測兩組小鼠耳、牙齦、皮膚微循環(huán)狀況;取小鼠肺、肝、胸主動脈進行免疫組化染色。培養(yǎng)人心臟微血管內皮細胞，分組給予通心絡和氯化鈷刺激，western bolt和Real-time方法分

4、別檢測緊密連接蛋白和KLF4的表達;過表達KLF4及過表達KLF4同時孵育通心絡，Western bolt和Real-time PCR檢測緊密連接蛋白的表達。
　　結果:
　　1.慢性缺氧誘導小鼠肝組織的HIF-1α表達慢性缺氧組肝組織內HIF-1α的陽性細胞數明顯多于正常對照組;三組相比，通心絡預孵育組小鼠肝組織內HIF-1α陽性細胞最為明顯，提示通心絡能提高小鼠對慢性缺氧的適應能力。
　　2.通心絡誘導缺氧肺、肝組

5、織新生血管的形成CD31是血管內皮細胞的標志因子，為了進一步觀察通心絡對缺氧小鼠新生血管生成的影響，我們通過免疫組化檢測CD31陽性細胞的數量以評價通心絡對新生血管生成的作用。結果顯示，通心絡預孵育組肺、肝組織內的CD31陽性細胞數及深染程度明顯高于缺氧組，提示通心絡可以誘導慢性缺氧小鼠的肺、肝組織內新生血管形成。
　　3.通心絡不改變缺氧小鼠耳、牙齦和皮膚的微循環(huán)狀況采用血液微循環(huán)檢測儀檢測小鼠耳、牙齦和皮膚的微循環(huán)狀況。結果顯

6、示，缺氧組和通心絡預孵育組小鼠的耳朵、牙齦和皮膚的微血管循環(huán)狀況無明顯差異。
　　4.通心絡促進缺氧誘導的內皮細胞增殖為進一步探討通心絡促進慢性缺氧小鼠血管新生的分子機制，我們以體外培養(yǎng)的血管內皮細胞為研究對象，以氯化鈷作為缺氧誘導因素，CCK-8法觀察通心絡對缺氧內皮細胞增殖的影響。結果顯示，通心絡預孵育可以顯著增加內皮細胞數量，說明通心絡可以濃度依賴性的促進缺氧誘導的內皮細胞增殖。
　　5.通心絡促進內皮細胞成血管內皮細

7、胞血管生成實驗結果顯示，通心絡預孵育組細胞與缺氧組相比，血管內皮細胞排列成血管網狀結構，細胞間的連接加強。提示，通心絡可以促使缺氧狀態(tài)下的內皮細胞成血管。
　　6.通心絡促進缺氧小鼠主動脈內皮細胞緊密連接蛋白和KLF4的表達血管緊密連接蛋白是決定血管內皮細胞間滲出的最主要結構蛋白，進一步研究發(fā)現，與缺氧組相比，通心絡預孵育可以顯著提高血管內皮緊密連接蛋白occludin，claudin1和KLF4的表達，對ve-cadherin和

8、beta-catenin的表達影響不明顯。提示通心絡誘導缺氧主動脈內皮細胞緊密連接蛋白的表達可能與KLF4有關。
　　7.KLF4可能介導通心絡誘導的內皮細胞緊密連接蛋白occludin和claudin1的表達Real-time PCR和Western blot結果顯示，通心絡預孵育可以顯著誘導HIF-1a、ve-cadherin、claudin1和KLF4的表達。過表達KLF4，ve-cadherin和beta-catenin的

9、表達沒有變化，occludin和claudin1的表達下降。通心絡預孵育后過表達KLF4， occludin和claudin1的表達明顯高于KLF4過表達組。上述結果提示，過表達KLF4抑制occludin和claudin1的表達（或影響不大），通心絡預孵育逆轉了KLF4的作用，顯著促進occludin和claudin1的表達，提示通心絡可能通過某種作用機制改變了KLF4的修飾狀態(tài)。
　　8.通心絡誘導緊密連接蛋白occludin

10、和claudin1表達與促進KLF4磷酸化有關。
　　為了進一步明確通心絡與KLF4之間的關系，我們用免疫共沉淀檢測了KLF4的磷酸化修飾狀態(tài)，結果顯示，通心絡可以促進KLF4磷酸化，提示，通心絡誘導緊密連接蛋白occludin和claudin1表達與促進KLF4磷酸化有關。
　　結論:
　　1.通心絡能提高慢性缺氧小鼠肝組織對缺氧的適應能力。
　　2.通心絡誘導慢性缺氧小鼠肺、肝組織中新生血管生成。