內(nèi)含長片段RNA的耐RNase病毒樣顆粒的原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)研究.pdf

1、目的：通過構(gòu)建雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)和單質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)兩種原核表達(dá)系統(tǒng)，并通過應(yīng)用19 mer莖環(huán)結(jié)構(gòu)的C-變異體和在目的序列中增加包裝位點(diǎn)的數(shù)量，探討構(gòu)建內(nèi)含大片段嵌合體RNA的耐核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)病毒樣顆粒(Virus-like Particles，VLPs)的可能性。 方法：雙質(zhì)粒系統(tǒng)表達(dá)內(nèi)含長片段嵌合體RNA的耐核糖核酸酶的VLPs:首先設(shè)計(jì)含Bam HI和Hind III酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增MS2

2、噬菌體的編碼成熟酶蛋白和衣殼蛋白的1，700 bp序列，Bam HI和Hind III酶切后，與用同樣酶切的表達(dá)載體pET-28(b)相連接，得到重組載體pET-MC。應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增3種病毒的6段嵌合體序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，使嵌合體兩端含有Fse I和Pac I酶切位點(diǎn)，F(xiàn)se I和Pac I酶切后，與用同樣酶切的表達(dá)載體pACYCDuet-1相連接，得到重組載體pACYC-3V。將雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21-DE3，通過

3、誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，將表達(dá)后的VLPs純化。應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證VLPs是否包裝了全長的RNA片段。然后進(jìn)行VLPs的穩(wěn)定性試驗(yàn)和應(yīng)用HCV RNA國際標(biāo)準(zhǔn)品定值含有嵌合體RNA的VLPs。 單質(zhì)粒系統(tǒng)表達(dá)耐RNase內(nèi)含長片段嵌合體RNA的VLPs：擴(kuò)增MS2噬菌體的編碼成熟酶蛋白和衣殼蛋白的1，700 bp序列，并將原來的19 mer的包裝位點(diǎn)序列改變?yōu)镃-變異體，酶切后，與用同樣酶切的表達(dá)載體pET-28(b)相連接，得到重組載

4、體pET-MS2-C。應(yīng)用重疊PCR擴(kuò)增3種病毒的5段嵌合體序列(3V-five，包括3段SARS-CoV基因、一段HCV基因和一段H5N1基因)，并在SABS-CoV3和HCV序列之間插入一個(gè)19 mer的變異體包裝位點(diǎn)序列，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，使嵌合體兩端含有Not I酶切位點(diǎn)，與Not I酶切的重組載體pET-MS2-C相連接，構(gòu)建得到表達(dá)載體pET-MS2-3V。同時(shí)構(gòu)建三種對照組表達(dá)載體N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C

5、和P-3V-pET-P。通過誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。最后分別測定N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-MS2-3V 4種表達(dá)產(chǎn)物的260 nm吸光度值(A260)，根據(jù)公式lA260=0．125 mg/mL計(jì)算4種表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)效率。 結(jié)果：雙質(zhì)粒系統(tǒng)表達(dá)內(nèi)含長片段嵌合體RNA的耐RNase的VLPs:成功構(gòu)建了兩種原核表達(dá)載體pET-MC和pACYC-3V。經(jīng)原核表達(dá)后得到含全長為2,248 nt

6、的三種病毒6段嵌合體RNA的VLPs;所包裝的RNA具有耐RNase和脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonulcease，DNase)消化的特性以及良好的不同溫度條件下的穩(wěn)定性。VLPs五個(gè)濃度(106、105、104、103和102 copies/mL)與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源定值結(jié)果分別是1.354×107 IU/mL、5.740×105 IU/mL、6.580×104 IU/mL、5.428×103IU/mL和9.613×102 IU

7、/mL。 單質(zhì)粒系統(tǒng)表達(dá)耐RNase內(nèi)含長片段嵌合體RNA的VLPs：成功構(gòu)建了4種原核表達(dá)載體：pET-MS2-3V、P-3V-pET-P、N-P3V-pET-P和N-P3V-pET-C。pET-MS2-3V和P-3V-pET-P經(jīng)原核表達(dá)后得到含全長為1,891 nt的5段嵌合體RNA的VLPs；N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C其原核表達(dá)產(chǎn)物VLPs中僅包裝了1,200 nt的目的嵌合體RNA。N-P3V-pE

8、T-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-MS2-3V的表達(dá)效率分別為0.23、0.35、0.35和0.51 mg/mL。N-P3V-pET-C比N-P3V-pET-P表達(dá)效率高52％，而pET-MS2-3V比P-3V-pET-P表達(dá)效率高38％。 結(jié)論：我們構(gòu)建的表達(dá)載體及原核表達(dá)系統(tǒng)，可作為構(gòu)建和制備耐RNase的含三種病毒嵌合體序列的VLPs的平臺，這種VLPs可以作為對同一個(gè)標(biāo)本進(jìn)行多個(gè)病毒的同時(shí)檢測