鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1的生物學(xué)特性及體內(nèi)具抗菌活性噬菌體篩選方法的建立.pdf

1、細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥性的不斷加劇嚴(yán)重威脅著公眾健康，這是全世界共同關(guān)注的重大問題。尤其是鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌以及銅綠假單胞菌，對(duì)所有常規(guī)使用抗生素全耐藥菌株的出現(xiàn)，使臨床醫(yī)生處于無藥可選的困境。更為嚴(yán)峻的是，目前處于臨床試驗(yàn)階段的新抗菌藥物種類非常有限，其中大多數(shù)仍是對(duì)傳統(tǒng)藥物的結(jié)構(gòu)修飾物。新型抗生素的研發(fā)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于細(xì)菌耐藥性的變異。人們意識(shí)到，抗生素治療細(xì)菌感染的時(shí)代已接近終點(diǎn)，尋找新的治療手段勢在必行。噬菌體以其殺菌特異性強(qiáng)，、

2、自然資源豐富、無毒無害以及易于生產(chǎn)和工程改造等優(yōu)點(diǎn)，為人類開發(fā)新型抗菌藥物提供有效手段。然而，用噬菌體防治細(xì)菌感染就必須先從環(huán)境中分離篩選到能高效殺滅各種致病菌的噬菌體，并對(duì)這些噬菌體的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，這是決定噬菌體治療成敗的基礎(chǔ)和前提。鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，因其耐藥性日趨嚴(yán)重，甚至已出現(xiàn)“全耐藥”菌株而受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。但目前國內(nèi)外對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體的研究卻非常有限。本文采用鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株為宿主菌

3、，從環(huán)境中成功分離到一株全新的能夠高效裂解此菌的噬菌體，命名為ZZ1。本文目的是研究噬菌體ZZ1的生物學(xué)特性，包括基因組測序和全基因組生物信息學(xué)的分析。同時(shí)，通過觀察尾靜脈注射ZZ1對(duì)全身感染小鼠的治療效果來評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。本文為采用噬菌體制劑防治細(xì)菌感染奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料與方法:
　　1鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1的分離及其生物學(xué)特性的研究
　　采集污水樣品，以鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株為指示菌分離噬菌體;挑取單個(gè)透明

4、噬菌斑，進(jìn)行多次單斑分離以純化噬菌體;采用液體增殖和平板固體增殖的方法增殖噬菌體ZZ1;采用PEG8000共沉淀、氯仿抽提的方法濃縮噬菌體ZZ1顆粒;采用氯化銫密度梯度離心法純化噬菌體ZZ1顆粒;透射電鏡觀察噬菌體ZZ1形態(tài);通過雙層平板法測定噬菌體ZZ1效價(jià)，調(diào)查噬菌體ZZ1的噬菌譜，并用通用引物擴(kuò)增16s rRNA、測序后進(jìn)行Blastn比對(duì)鑒定其宿主種類，繪制噬菌體ZZ1的一步生長曲線，檢測噬菌體ZZ1對(duì)溫度、pH等理化因素的穩(wěn)定

5、性，測定噬菌體ZZ1殺滅其宿主菌的最佳溫度范圍。采用MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit提取噬菌體ZZ1基因組;用DNaseⅠ(RNase Free)，RNaseA(DNase Free)和HindⅢ的酶解作用鑒定基因組類型;用Covaris S220將噬菌體ZZ1DNA隨機(jī)打成約500bp長的片段，T4 DNA Polymerase、Klenow Fragment以及T4 Polynucleotid

6、e Kinase進(jìn)行5'末端的修平和磷酸化，Klenow Fragment exo進(jìn)行3'末端加“A”，T4 DNA ligase連接通用接頭、PCR擴(kuò)增構(gòu)建噬菌體ZZ1測序文庫;Hiseq2000上機(jī)測序，Velvet1.2.08進(jìn)行序列拼接。
　　2鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1全基因組生物信息學(xué)分析
　　應(yīng)用GeneMarkS軟件和fgenesV0軟件預(yù)測ZZ1的蛋白編碼區(qū);采用本地BlastP對(duì)所預(yù)測到的基因進(jìn)行功能預(yù)測，

7、利用Batch CD-search預(yù)測蛋白保守區(qū);用ProtParam tool預(yù)測ZZ1蛋白的分子量和等電點(diǎn);用DNAStar Lasergene7.1軟件預(yù)測ZZ1基因的GC含量;用在線軟件TMpred預(yù)測蛋白跨膜區(qū);用Mauve2.2.0和CoreGenes3.5分別在核酸水平以及蛋白水平進(jìn)行全基因組比較分析;用GenSkew分析ZZ1基因組GC偏移和預(yù)測復(fù)制起點(diǎn);用tRNAscan-SE1.21和ARAGORN進(jìn)行tRNA預(yù)測，

8、Blastn對(duì)預(yù)測的tRNA進(jìn)行相似性比對(duì);密碼子偏嗜性分析采用EMBOSS(6.2.0)軟件包中的CUSP和CAI程序。
　　3鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1體內(nèi)失活因素及體外篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的建立及其初步評(píng)價(jià)
　　調(diào)查小鼠體內(nèi)影響噬菌體ZZ1活性的因素，包括采用噬菌斑減少中和試驗(yàn)檢測小鼠血清中是否存在能中和噬菌體ZZ1的天然抗體;觀察分析噬菌體ZZ1在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，明確網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)ZZ1活性的影響;比較噬

9、菌體ZZ1在補(bǔ)體滅活血清以及補(bǔ)體未滅活血清中對(duì)其敏感宿主菌AB09V的殺滅作用，分析血清補(bǔ)體對(duì)ZZ1體內(nèi)抗菌活性的影響。選擇其他4株新分離到的噬菌體(F19、PG3、PG17和L2)，體外實(shí)驗(yàn)中觀察到他們分別可以特異性感染并高效殺滅4株不同的多重耐藥致病菌（肺炎克雷伯菌KP-19，陰溝腸桿菌EC3，陰溝腸桿菌EC17和銅綠假單胞菌PA2）。利用血清中噬菌體的殺菌實(shí)驗(yàn)從這4株噬菌體中初步篩選出可能具有治療作用的噬菌體，進(jìn)一步觀察血清中殺菌

10、呈陽性的噬菌體通過尾靜脈注射后對(duì)全身感染致死量其宿主菌的小鼠的治療效果，初步評(píng)價(jià)血清中噬菌體殺菌實(shí)驗(yàn)篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的效果。
　　結(jié)果:
　　1鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1的生物學(xué)特性
　　噬菌體ZZ1在鮑曼不動(dòng)桿菌AB09V的菌苔上形成直徑為1～2mm的透明噬菌斑，表現(xiàn)出裂解性噬菌體的噬斑特征;透射電鏡觀察顯示ZZ1有一個(gè)較長的二十面體立體對(duì)稱的頭部（約100nm長80nm寬）和一個(gè)可以伸縮的尾部（約120n

11、m長），此為有尾噬菌體目肌尾病毒科噬菌體的典型形態(tài);噬菌譜調(diào)查結(jié)果顯示ZZ1對(duì)本研究涉及的非鮑曼不動(dòng)桿菌無裂解作用，僅對(duì)23株鮑曼不動(dòng)桿菌中的3株顯示裂解作用，在相同培養(yǎng)條件下，這3株宿主菌對(duì)ZZ1的敏感程度由大到小依次為AB09V、AB0901和AB0902。一步生長曲線顯示ZZ1感染AB09V后其潛伏期約為9 min，爆發(fā)量約200 PFU/細(xì)胞。理化因素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZZ1可以耐受較寬的酸堿環(huán)境(pH4～9)以及50℃和60

12、℃范圍的較高溫度。噬菌體ZZ1在35℃～39℃均可保持穩(wěn)定的最佳抗菌活性，噬菌體ZZ1的基因組核酸不能被RNaseA(DNase Free)降解，但可被DNaseⅠ(RNase Free)和HindⅢ降解，因此其基因組核酸類型為dsDNA。對(duì)構(gòu)建好的噬菌體ZZ1基因組測序文庫進(jìn)行雙端測序獲得總的讀長數(shù)目為937，400個(gè)，平均讀長為250 bp，最后應(yīng)用velvet軟件拼接出一條長為166，801 bp的噬菌體基因組，其兩端帶有114b

13、p的重復(fù)序列。
　　2鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1全基因組生物信息學(xué)分析
　　ZZ1基因組非重疊序列全長166，687 bp，平均GC含量為34.4％，低于鮑曼不動(dòng)桿菌GC含量(38.9％～39.2％);ZZ1基因組共預(yù)測到256個(gè)CDS和8個(gè)tRNA，基因組平均每1kb編碼1.5個(gè)基因，基因密度約為93.6％，基因長度范圍為34aa～1303aa，平均203aa。256個(gè)預(yù)測蛋白中，有95個(gè)(37.1％)可注釋出功能，這些蛋白

14、均是T4-1ike蛋白，包括36個(gè)噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，21個(gè)參與DNA復(fù)制、重組、修復(fù)、包裝和加工處理的功能蛋白，11個(gè)參與核酸代謝的蛋白，5個(gè)參與噬菌體裝配調(diào)節(jié)的蛋白，7個(gè)參與轉(zhuǎn)錄的蛋白，3個(gè)參與翻譯的蛋白，3個(gè)參與裂解宿主菌的蛋白，5個(gè)參與關(guān)閉或改變宿主菌代謝的蛋白，2個(gè)參與細(xì)菌與噬菌體相互作用的蛋白，其余2個(gè)為移動(dòng)元件。在161個(gè)功能未知的ZZ1預(yù)測蛋白中，有37個(gè)具有跨膜區(qū)，有23個(gè)具有保守的結(jié)構(gòu)域。其中ZZ1的CDS011被預(yù)測出

15、屬多重耐藥超家族，其編碼的蛋白具有四個(gè)跨膜區(qū)。此外，在ZZ1的基因組中并未發(fā)現(xiàn)其他耐藥基因和毒力因子。
　　噬菌體ZZ1與GenBank中其他4株不動(dòng)桿菌屬噬菌體(Acj9、Acj61、Ac42和133)以及大腸桿菌噬菌體T4的比較基因組學(xué)研究揭示出11組不同長度的局部同線塊(local colinear block，LCB)，其中有7組LCB(＞10 kb)為6株噬菌體所共有。BlastP和CoreGenes分析顯示:ZZ1的預(yù)

16、測蛋白中有110個(gè)（占總基因數(shù)的43％）與T4蛋白具有顯著相似性（E value＜10-6）;ZZ1與Acj9、Acj61、133以及Ac42含有的同源基因總數(shù)分別為179、164、157和143個(gè)，分別占噬菌體ZZ1總預(yù)測蛋白數(shù)的69.9％、64.1％、61.3％和55.9％;這些結(jié)果表明ZZ1與這5株噬菌體有共同的祖先，因此，噬菌體ZZ1屬于T4-like噬菌體家族。
　　GC skew預(yù)測結(jié)果顯示ZZ1的復(fù)制起點(diǎn)在nt810

17、09，復(fù)制終點(diǎn)在nt1。其中復(fù)制起點(diǎn)與8個(gè)tRNA所在的位置非常接近;ZZ1編碼tRNA的種類和數(shù)量雖與其他鮑曼不動(dòng)桿菌編碼的tRNA均不同，但其tRNA與他們編碼的tRNA卻有著不同程度的核酸序列相似性，這些高度保守的tRNA可能具有某些可通過垂直進(jìn)化遺傳下來的重要的生物學(xué)功能。此外，雖然ZZ1編碼的tRNA有一半以上(5/8)攜帶的密碼子是噬菌體ZZ1總蛋白高頻使用的密碼子，但其他4株不動(dòng)桿菌屬噬菌體的tRNA所攜帶的密碼子與噬菌體

18、本身高頻使用的密碼子一致的并不到總tRNA的50％。
　　3鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體ZZ1體內(nèi)失活因素及體外篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的建立及其初步評(píng)價(jià)
　　噬菌體ZZ1對(duì)絕對(duì)致死量的AB09V感染小鼠無治療效果(p＞0.05)。ZZ1體內(nèi)失活原因的研究調(diào)查結(jié)果顯示，小鼠血清中不存在可中和噬菌體ZZ1的天然抗體，ZZ1的失活與小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)噬菌體的清除也無直接關(guān)系，但血清補(bǔ)體與AB09V的相互作用完全抑制了ZZ1的吸附活性，

19、這是導(dǎo)致ZZ1在小鼠體內(nèi)失去抗菌活性的主要原因。因此，體外觀察噬菌體在離體組織（如血清、抗凝全血、或其他組織的勻漿）中的抗菌活性可作為篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體的有效方法。
　　為初步評(píng)價(jià)在離體組織中噬菌體殺菌實(shí)驗(yàn)篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的效果，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇了4株新分離到的在體外能高效殺滅其敏感宿主菌的噬菌體（F19、PG3、PG17和L2），在小鼠血清中具有殺菌作用的噬菌體共3株，分別是F19、PG3和PG17。這3株噬菌體

20、對(duì)全身感染絕對(duì)致死量細(xì)菌的小鼠的治療結(jié)果表明，感染小鼠1周內(nèi)的存活率在F19噬菌體治療組為100％(8/8)，在PG3噬菌體治療組為87.5％(7/8)，在PG17噬菌體治療組為87.5％(7/8)。3株噬菌體在小鼠各臟器對(duì)其敏感宿主菌的殺滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，噬菌體治療組小鼠各組織臟器含活菌量與無噬菌體治療對(duì)照組相比均有明顯降低(p＜0.001)。此外，熱滅活噬菌體對(duì)感染小鼠均無治療作用（存活率為0％，0/8），小鼠各組織臟器含菌量與無噬菌

21、體治療對(duì)照組相比也均無明顯變化(p＞0.05)，說明小鼠各臟器活菌數(shù)的減少與噬菌體的非特異性免疫增強(qiáng)作用無關(guān)。這些結(jié)果均證明:3株血清中殺菌呈陽性反應(yīng)的噬菌體通過尾靜脈注射后對(duì)全身感染絕對(duì)致死量其宿主菌的小鼠具顯著治療效果。此結(jié)果初步證實(shí)了本研究所建立的在離體組織中噬菌體的殺菌實(shí)驗(yàn)篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的有效性。
　　結(jié)論:
　　1.噬菌體ZZ1是一株有尾噬菌體目肌尾病毒科的裂解性噬菌體。鮑曼不動(dòng)桿菌AB09V是其最為

22、敏感的宿主菌，在其菌苔上形成直徑為1～2mm的透明噬菌斑，感染潛伏期為9min，爆發(fā)量為200 PFU/cell; ZZ1在極端溫度和極端pH的環(huán)境下具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在35℃～39℃均可顯示最佳的抗菌活性。
　　2.噬菌體ZZ1的基因組為dsDNA，全長166，687 bp，平均GC含量為34.4％。含有256個(gè)CDS和8個(gè)tRNA。能夠注釋出功能的CDS有95個(gè)，他們大多數(shù)為病毒結(jié)構(gòu)蛋白和參與DNA復(fù)制的功能蛋白。比較基因組學(xué)