自噬在維持急性冷暴露大鼠肝臟能量代謝中的作用.pdf

1、背景：
　　冷暴露是常見的特殊環(huán)境暴露因素。以往的研究發(fā)現(xiàn)，-15℃急性冷暴露0.5h可以引起大鼠肝臟能量水平的改變及相關細胞通路活性的變化，復方制劑可以顯著緩解急性冷暴露大鼠體溫下降，但其機制仍不清楚。自噬是細胞正常生理過程，可以清除損傷細胞器，提供能量代謝底物并抑制凋亡發(fā)生；能量應激情況下，自噬可以維持細胞ATP水平。設想急性冷暴露能否引起肝臟細胞自噬水平改變及其產(chǎn)生的影響，復方制劑能否影響急性冷暴露大鼠肝臟能量水平及自噬是否

2、參與復方制劑提高大鼠耐寒能力的過程值得探討。
　　目的：
　　通過建立大鼠急性冷暴露模型，觀察急性冷暴露對大鼠肝細胞能量水平及細胞凋亡的影響，探討自噬水平變化產(chǎn)生的影響及調(diào)控機制，并進一步探討自噬在復方制劑調(diào)控急性冷暴露條件下大鼠肝細胞能量水平及細胞凋亡中的作用及機制。為闡明急性冷暴露對機體造成的損傷、急性冷暴露過程中機體能量的調(diào)控及復方制劑提高耐寒能力的作用機制提供理論依據(jù)，為冷暴露條件下的機體防護措施提供理論基礎。

3、>　　方法：
　　1.急性冷暴露模型的建立：雄性SD大鼠230g±10 g體重，獨立暴露于-15℃低溫試驗艙，暴露時間為4 h。
　　2.肝臟糖原含量測定：用肝糖原檢測試劑盒測定大鼠肝組織肝糖原水平。
　　3.肝臟細胞能量水平測定：用ATP檢測試劑盒，通過多功能酶標儀進行發(fā)光度測定并得到大鼠肝細胞ATP含量值。
　　4.凋亡水平檢測：用western blot方法測定肝細胞凋亡相關蛋白caspase-3活化水平及

4、TUNEL染色法觀察TUNEL陽性細胞。
　　5.自噬水平檢測：用western blot方法測定肝細胞自噬標志物LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達變化；用免疫組化方法，通過MDC染色方法進行肝細胞自噬水平的檢測。
　　6.自噬抑制劑對機體的影響：采用腹腔注射的方法，降低自噬水平，同時觀察其對肝組織冷暴露應激狀態(tài)下能量代謝可能產(chǎn)生的影響。
　　7.復方制劑對機體的影響：采用連續(xù)灌胃方法，持續(xù)灌胃3天。觀察能量及自噬水平的變化

5、。
　　結果：
　　1.急性冷暴露對大鼠肝細胞凋亡水平的影響
　　-15℃急性冷暴露4 h引起大鼠肝細胞凋亡增加。急性冷暴露組大鼠肝細胞 caspase-3剪切水平顯著增加，TUNEL陽性細胞數(shù)顯著增加（p＜0.05）。
　　2.急性冷暴露對大鼠肝臟ATP及肝糖原水平的影響
　　-15℃急性冷暴露4 h引起大鼠肝臟細胞ATP、肝糖原水平顯著下降。室溫對照組大鼠肝糖原5.03±0.86 mg/g，而冷暴露對照

6、組大鼠肝糖原降至2.24±1.03 mg/g；對照組大鼠ATP水平為0.293±0.018μmol/mg，冷暴露4 h組大鼠ATP水平降低至0.195±0.044μmol/mg。兩者均具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。
　　3.急性冷暴露對肝臟自噬水平的影響
　　MDC染色檢測發(fā)現(xiàn)，-15℃急性冷暴露4小時引起肝細胞自噬泡數(shù)量增加，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；WB檢測發(fā)現(xiàn)LC3-II灰度水平在急性冷暴露后顯著升

7、高（p＜0.05）。提示急性冷暴露引起大鼠肝臟自噬水平顯著增加。
　　4.自噬抑制劑對急性冷暴露大鼠肝臟細胞凋亡水平、能量水平及自噬水平的影響
　　腹腔注射自噬抑制劑渥曼霉素可以顯著降低肝細胞自噬水平（p＜0.05），渥曼霉素引起急性冷暴露大鼠肝細胞凋亡水平顯著升高，進一步增加caspase-3蛋白的剪切及TUNEL染色陽性細胞數(shù)量（p＜0.05），并引起肝細胞 ATP含量顯著降低，冷暴露抑制劑組大鼠ATP水平為0.146±

8、0.018μmol/mg與冷暴露對照組大鼠ATP水平0.193±0.047μmol/mg相比具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。而冷暴露抑制劑組大鼠肝糖原水平與冷暴露對照組大鼠相比無明顯差異。
　　5.復方制劑對急性冷暴露大鼠肝細胞凋亡水平、肝臟能量水平及肝細胞自噬水平的影響
　　復方制劑灌胃3天可以顯著降低急性冷暴露大鼠肝細胞凋亡水平（p＜0.05），并提高急性冷暴露大鼠的肝臟細胞 ATP及肝糖原水平，并同時降低肝組織的自噬水

9、平。冷暴露復方制劑組的大鼠ATP水平為0.236±0.018μmol/mg，與冷暴露對照組大鼠ATP水平0.187±0.030μmol/mg相比具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），冷暴露復方制劑組大鼠肝糖原2.20±1.24 mg/g，而冷暴露對照組大鼠肝糖原降至1.38±0.97 mg/g，相比具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。
　　結論：
　　1.急性冷暴露可以引起大鼠肝細胞凋亡，肝細胞能量水平降低，并引起細胞自噬水平增加。<