烏司他丁對(duì)心腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及分子生物學(xué)機(jī)制.pdf

1、缺血性心腦血管疾病具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類的健康。即便重癥醫(yī)學(xué)和介入治療實(shí)現(xiàn)了盡早恢復(fù)血流供應(yīng)，但恢復(fù)血流灌注的同時(shí)不可避免地引發(fā)再灌注損傷，其致殘率與病死率依然很高。缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)的機(jī)制涉及細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體功能紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凋亡、自噬等動(dòng)態(tài)、快速發(fā)展的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。如何在恢復(fù)血流供應(yīng)的同時(shí)，又能減輕再灌注損傷是缺血性心腦血管疾病防

2、治的重要課題。烏司他丁(ulinastatin，UTI)是從健康成年男性尿液中提取的糖蛋白水解酶抑制劑，已廣泛應(yīng)用于包括全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥、休克、彌散性血管內(nèi)凝血、重癥急性胰腺炎、心肺復(fù)蘇術(shù)后、移植及缺血再灌注損傷等多個(gè)臨床領(lǐng)域。有較多證據(jù)表明其具有清除自由基及抑制炎性介質(zhì)釋放等作用，但其具體的作用和分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確，且其對(duì)缺血再灌注后大腦學(xué)習(xí)記憶功能的作用也不清楚。近年來，國內(nèi)外對(duì)缺血后處理的研究日漸增多，提出了藥物后處

3、理的概念，其在操作上具有更好的可控性，更加可行和方便，在再灌注階段經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療使得將藥物靶向運(yùn)輸?shù)焦诿}內(nèi)皮和心肌組織成為可能。給藥方式的日趨靶向化，使得患者將從再灌注治療中進(jìn)一步獲益。
　　 本研究旨在研究烏司他丁對(duì)心、腦缺血再灌注損傷的影響及其具體分子作用機(jī)制，對(duì)再灌注損傷后學(xué)習(xí)記憶功能的影響；比較烏司他丁藥物后處理在心肌再灌注治療中經(jīng)冠脈途徑給藥是否優(yōu)于外周靜脈給藥，探討心肌再灌注治療中更適宜的給藥途徑。
　　

4、 目的：探討烏司他丁對(duì)心、腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 方法：第一部分：烏司他丁對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組(sham group)、缺血再灌注組(ischemia/reperfusion group，I/R group)、烏司他丁高劑量組(40000U/kg)、烏司他丁中劑量組(20000U/kg)、烏司他丁低劑量組(10

5、000U/kg)。分別于缺血即刻由腹腔注射給藥。缺血2 h后將線栓拔出實(shí)現(xiàn)再灌注，再灌注24 h后進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)檢查。采用組織病理學(xué)法觀察海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化；免疫組化法檢測(cè)缺血側(cè)腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase，MMP-9)的表達(dá)；Western blot檢測(cè)缺血側(cè)腦組織中核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)、細(xì)胞間粘附分子(intercellul

6、ar adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的含量；生物化學(xué)比色法測(cè)定腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、脂過氧化產(chǎn)物丙

7、二醛(malondialdehyde，MDA)的水平。另取大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。
　　 第二部分：烏司他丁對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30分鐘，再灌注3小時(shí)制備大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組，心肌缺血再灌注組(I/R group)，缺血后處理組(ischemia postconditioning group，I-postC group)，烏司他丁冠脈

8、途徑給藥組(10000U/kg)，烏司他丁尾靜脈途徑給藥組(10000U/kg)。采用硝基四氮唑藍(lán)(nitro blue tetrazolium，NBT)染色法檢測(cè)心肌梗死面積；HE染色觀察心肌形態(tài)學(xué)變化；心電圖記錄組間多時(shí)間點(diǎn)對(duì)比變化；酶聯(lián)免疫檢測(cè)法測(cè)定血清TNF-α、IL-10的含量；生物化學(xué)比色法測(cè)定血清SOD、MDA及一氧化氮(nitricoxide，NO)的水平。
　　 結(jié)果：第一部分：烏司他丁對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作

9、用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 大鼠局灶性腦缺血2h再灌注24h后，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損體征，主要表現(xiàn)為提尾懸空時(shí)，右前肢屈曲、內(nèi)收緊貼胸壁，肩內(nèi)旋，行走時(shí)向偏癱側(cè)旋轉(zhuǎn)，同側(cè)肌張力下降，表明模型制作成功；HE染色顯示缺血側(cè)腦組織海馬CA1區(qū)有明顯的缺血及壞死表現(xiàn)；烏司他丁各劑量組均可明顯改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能障礙，減輕海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞損傷程度。Western blot結(jié)果顯示，缺血再灌注組大鼠缺血側(cè)腦組織中ICAM-1及NF-

10、κB p65蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高；烏司他丁各劑量可不同程度地降低缺血側(cè)腦組織中ICAM-1和NF-κBp65的表達(dá)。由酶聯(lián)免疫檢測(cè)結(jié)果可見，腦缺血再灌注損傷還可引起TNF-a等致炎因子及IL-10抗炎因子水平的升高；烏司他丁各劑量組可明顯降低由缺血再灌注所引起的TNF-α表達(dá)水平的升高，且升高抗炎因子IL-10的水平。生化檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果顯示，大鼠腦缺血2h再灌注24h后，腦組織勻漿中的MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低。烏司

11、他丁各劑量組可顯著降低腦組織勻漿中的MDA含量，升高SOD的活性。Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，烏司他丁各劑量組與模型組比較可使逃避潛伏期縮短，平臺(tái)象限距離百分比增加，穿越平臺(tái)次數(shù)增加。
　　 第二部分：烏司他丁對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 心電圖結(jié)果顯示模型組ST段、T波明顯升高、病理性Q波的出現(xiàn)明顯增多，與假手術(shù)組相比具有顯著性差異(P<0.05)；各治療組所測(cè)時(shí)間點(diǎn)心電圖ST段、T波恢復(fù)明顯優(yōu)于缺

12、血再灌損傷組，病理性Q波的出現(xiàn)顯著減少。病理組織切片顯示各治療組與I/R組相比，心肌纖維相對(duì)規(guī)整、出血少，心肌纖維少量斷裂，胞漿染色色淡，炎性細(xì)胞浸潤少。I/R組的梗死面積高達(dá)45.15％±3.36％，各治療組梗死面積均顯著性縮小。生物化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠的血清MDA活性顯著增高，血清中抗氧化酶SOD活力降低，并有NO活性顯著下降。與I/R組相比，缺血后處理和UTI后處理的2組均能夠降低MDA的水平，提高SOD的

13、活性和NO的水平；且烏司他丁冠狀動(dòng)脈給藥比尾靜脈給藥及機(jī)械性缺血后處理更能有效降低血清中MDA的水平，提高SOD的活性和NO的水平，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，I/R組TNF-α、IL-10水平顯著升高；經(jīng)過缺血后處理和UTI后處理，大鼠TNF-α水平降低，IL-10水平進(jìn)一步升高。
　　 結(jié)論：烏司他丁可改善大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺損，減輕海馬CA1區(qū)損傷程度，增強(qiáng)腦缺血再

14、灌注損傷大鼠認(rèn)知記憶能力，對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有良好的保護(hù)作用。烏司他丁可通過減輕大鼠缺血再灌注后腦組織中性粒細(xì)胞浸潤，降低粘附分子ICAM-1和促炎因子MMP-9、TNF-α的水平，升高抗炎因子IL-10的水平，降低NF-κB的表達(dá)水平及降低MDA的含量，升高抗氧化介質(zhì)SOD的含量來減輕缺血再灌注后腦組織的損傷，發(fā)揮其保護(hù)作用。
　　 烏司他丁藥物后處理能產(chǎn)生與機(jī)械性缺血后處理相似的保護(hù)效應(yīng)；烏司他丁可能是通過降低NO