非融合雙靶點(diǎn)重組TK-IRES-Tum5腺相關(guān)病毒構(gòu)建及體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　前列腺癌(prostate cancer,PCa)持續(xù)增長(zhǎng)的發(fā)病率和持續(xù)增加的死亡率是目前非常重要的一個(gè)公眾問題。目前治療PCa的方法包括外科手術(shù)、放射治療和內(nèi)分泌治療等。但是這些方法對(duì)激素非依賴PCa治療效果不夠理想?；蛑委熓悄壳坝锌赡苤斡[瘤的一種方法。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建腫瘤血管內(nèi)皮抑素功能片段(Tum5)和自殺基因(TK)非融合重組腺病毒相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV),AAV感染P

2、Ca細(xì)胞后持續(xù)地表達(dá)、分泌Tum5蛋白,阻止腫瘤內(nèi)部新生血管形成,雙靶位治療PCa。
　　目的:
　　1.構(gòu)建pAAV-TK、pAAV-Tum5、pAAV-TK-IRES-Tum5、pAAV-Tum5-IRES-TK質(zhì)粒。
　　2.rAAV-TK、rAAV-Tum5、rAAV-TK-IRES-Tum5、rAAV-Tum5-IRES-TK病毒顆粒的包裝、濃縮、純化與鑒定。
　　3.基因重組腺相關(guān)病毒rAAV-TK、

3、rAAV-Tum5、rAAV-TK-IRES-Tum5、rAAV-Tum5-IRES-TK的體外功能實(shí)驗(yàn)。
　　方法:
　　1.通過基因重組技術(shù)將Tum5和HSV-TK基因克隆入pIRES-MCS的不同位點(diǎn),構(gòu)建pAAV-TK、pAAV-Tum5、pAAV-TK-IRES-Tum5、pAAV-Tum5-IRES-TK質(zhì)粒,通過酶切鑒定載體質(zhì)粒正確。
　　2.采用HEK293細(xì)胞包裝病毒AAV Help free系統(tǒng)轉(zhuǎn)染

4、;采用氯仿-PEG/NaCl-氯仿抽提分離、濃縮和純化病毒。
　　3.培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞(PC3)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),通過熒光顯微鏡、實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot檢測(cè)病毒感染效率,通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,通過流式細(xì)胞儀和MTT法觀察細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建pAAV-TK、pAAV-Tum5、pAAV-TK-IRES-Tum5、pAAV-Tum5-IR

5、ES-TK質(zhì)粒。成功得到濃縮的重組腺相關(guān)病毒 rAAV-Tum5、rAAV-TK、rAAV-Tum5-IRES-TK、rAAV-TK-IRES-Tum5。
　　2.rAAV-Tum5、rAAV-TK、rAAV-Tum5-IRES-TK、rAAV-TK-IRES-Tum5均能夠順利感染PC3及HUVEC細(xì)胞,并能夠表達(dá)目的蛋白,Tum5蛋白能夠抑制HUVEC的成管能力,促進(jìn)HUVEC凋亡,轉(zhuǎn)染TK基因的PC3細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例要遠(yuǎn)大于