重組Ad-hTERTp-HSV-TK-GCV系統(tǒng)的構建及抗肝癌實驗研究.pdf

1、目的： 本課題擬構建hTERT啟動子調(diào)控的HSV—TK基因重組腺病毒載體系統(tǒng)，觀察Ad—hTERTp—HSV—TK/GCV系統(tǒng)對人肝癌細胞株HepG2的殺傷作用及其過程中的旁觀者效應，為肝癌的自殺基因靶向治療提供新的實驗依據(jù)。 方法： 1．將穿梭質粒pSU—Tp—TK與腺病毒骨架質粒pBHGE3共轉導至HEK293細胞，利用細胞內(nèi)同源重組法構建出hTERT啟動子調(diào)控的攜帶TK基因的復制缺陷型腺病毒Ad—hTERT

2、p—HSV—TK載體系統(tǒng)，經(jīng)PCR鑒定正確后進行擴增、純化及滴度測定； 2．將不同感染復數(shù)(MOI=1、10、100、1000)的重組腺病毒Ad—hTERTp—HSV—TK系統(tǒng)感染肝癌細胞HepG2及正常肝細胞L—02，加入不同濃度的GCV(0、1、10、100、1000μg/ml)，觀察Ad—hTERTp—HSV—TK對肝癌細胞生長的抑制作用及在GCV作用下TK基因的表達產(chǎn)物所致的肝癌細胞的自殺作用，MTT法檢測細胞活力，流式

3、細胞儀檢測細胞凋亡； 3．將Ad—hTERTp—HSV—TK載體系統(tǒng)感染后的TK陽性HepG2細胞和未感染的TK陰性HepG2細胞按0、1：9、2：8、3：7、……、1混合培養(yǎng)，并分別加入100μg/ml的GCV，MTT法檢測細胞存活率，觀察其旁觀者效應的作用。 結果： 1．穿梭質粒與腺病毒骨架質粒共轉導HEK293細胞，10天后HEK293細胞中出現(xiàn)典型的細胞病變，提取病毒DNA，經(jīng)PCR鑒定正確并經(jīng)擴增、純化

4、，50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測定病毒滴度為1.5×1010pfu/ml； 2．MTT法檢測到肝癌細胞HepG2的存活率隨著病毒MOI和GCV濃度的增加而逐漸降低，而同等條件下正常肝細胞L—02細胞的存活率無明顯改變；流式細胞儀檢測到當病毒MOI=100，GCV濃度=100μg/ml時HepG2細胞的凋亡率可達87.02％，而L—02細胞僅為12.51％： 3．旁觀者效應的觀察結果表明，當TK陽性HepG2細