口服重組沙門菌SL7207-mtHSP70-HSV-TK靶向抗小鼠黑色素瘤實驗研究.pdf

1、惡性黑素瘤(malignant melanoma)是來源于黑色素細胞的惡性腫瘤,是一類起源于神經(jīng)嵴黑色素細胞的惡性腫瘤,可發(fā)生于皮膚、粘膜,且發(fā)生于口腔粘膜的惡性黑色素瘤是口腔惡性腫瘤中惡性程度最高的腫瘤,占全身惡件腫瘤的1％～2％。而在我國與東南亞地區(qū)發(fā)生于口腔黏膜者反比面部皮膚多,占約80％以上。近年來許多調(diào)查表明,惡性黑色素瘤的發(fā)病率不斷地增高,且約70％早期轉(zhuǎn)移至區(qū)域性淋巴結(jié),還可經(jīng)血流遠處轉(zhuǎn)移至肺、肝、骨、腦等器官,其遠處轉(zhuǎn)移

2、率可高達40％以上。傳統(tǒng)治療腫瘤的方法:手術(shù)、放療、化療以及輔助療法雖取得了不錯的成效,但惡性黑素瘤細胞對化療藥物相對不敏感,對放射存在一定的抗拒性；并且B16黑色素瘤是基于黑色素瘤腫瘤細胞,具有高致瘤性以及低免疫原性,目前尚無治療的良策,故尋求一種安全有效的防治惡性黑素瘤的方法迫在眉睫。
　　 但是腫瘤細胞的多態(tài)性、高致瘤性以及低免疫原性依然是其難以攻克的重要因為。如何突破腫瘤的免疫耐受及腫瘤細胞的免疫逃逸機制,激活機體免疫系

3、統(tǒng)識別并殺傷腫瘤細胞是腫瘤疫苗設(shè)計時需要解決的根木問題。而熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)可以結(jié)合細胞內(nèi)的自我與非自我的全部異常的蛋白降解產(chǎn)物--多肽,形成帶有該細胞的全部特征性指紋的HSP-肽復(fù)合物(HSPpeptide complexes,HSP-PCs),因此HSP-PCs是多價的,這有利于抑制免疫逃逸從而提高機體的免疫作用。
　　 腫瘤基因治療的另一障礙是不能靶向性將抗腫瘤基因傳遞到腫瘤組織內(nèi),

4、這需要建立有效的向靶細胞轉(zhuǎn)移目的基因的載體系統(tǒng)。近年來研究較多的病毒載體(如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒等),存在的最主要的缺點就是多數(shù)實體腫瘤中存在的乏氧現(xiàn)象會大大削弱病毒載體的功能和目的基因的表達。而減毒沙門氏菌是腸道兼性厭氧菌,實體腫瘤乏氧現(xiàn)象恰恰為其提供了適合聚集生長和繁殖的場所；同時減毒沙門菌也是一種侵襲懷胞內(nèi)菌,主要通過M細胞進入腸上皮,被巨噬細胞和樹突狀細胞吞噬后攜帶至淋巴結(jié)、脾臟和其他組織。以上兩種特性為減毒沙門氏菌用

5、作口服型腫瘤基因的靶向載體提供了可能。同時它對腫瘤細胞具有侵襲性,在腫瘤細胞內(nèi)有限復(fù)制,且易于以抗生素清除,具有良好的生物安全性。
　　 目前,腫瘤基因治療的研究越來越深入,單基因治療暴露出許多的不足,最主要的是易引起藥物耐受。為解決這一問題,許多學(xué)者采用聯(lián)合基因療法,并已取得了相當可喜的成績。但目前大都以融合基因的形式,自身存在許多缺點,最主要的缺點是融合蛋白的不穩(wěn)定性,它容易發(fā)生降解,其次融合蛋白不易正確折疊,難以保證各組分

6、在融合之后仍保持原來的活性。利用減毒沙門菌作為基因疫苗載體,它可分別將單個基因轉(zhuǎn)入沙門菌中,避免了融合基因葉兩個基因表達相互干擾的問題；同時也使兩類基因產(chǎn)生協(xié)同作用,突破了對腫瘤細胞類型的依賴性,盡可能地消除了瘤細胞對藥物的耐受性。
　　 結(jié)合以上幾種因為,本課題以減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207為載體,利用mtHsp70的免疫佐劑作用和HSV-TK對腫瘤細胞殺傷效應(yīng)以及其旁觀者效應(yīng),制備重組減毒沙門菌:SL7207/mtHSP7

7、0/HSV-TK雙基因真核共表達的DNA疫苗口服液,建立小鼠黑色素瘤B16動物模型,擬制備的重組沙門菌口服液治療荷B16黑色素瘤小鼠,觀察減毒沙門菌對腫瘤的靶向性,以及重組菌的抑瘤效應(yīng)及其可能機制。
　　 本研究共分為兩章:第一章 口服攜帶EGFP的重組沙門菌對腫瘤的靶向性；第二章 口服mtHSP70/HSV-tk重組沙門菌對小鼠黑色素瘤的抑制作用。
　　 第一章 口服攜帶EGFP的重組沙門菌對腫瘤的靶向性
　　

8、 1.目的:
　　 研究減毒的沙門氏菌SL7207對于腫瘤組織的靶向性。
　　 2.方法:
　　 將本課題組前期已制備并通過鑒定的含綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)的重組沙門菌復(fù)蘇,制備以EGFP為報告基因的重組沙門菌(SL7207/PCMV-IRES-EGFP)口服液(濃度為109 CFU/ml),以100μl灌胃飼服荷B16黑色素瘤小鼠,通過組織冰凍

9、切片及組織勻漿菌落計數(shù)方法研究不同時間點細菌在腫瘤組織中和正常組織中的分布情況。
　　 3.結(jié)果:
　　 在口服重組沙門菌后第2天,肝臟、脾臟及腫瘤組織勻漿中均有少數(shù)菌落生長；而第4天,肝臟、脾臟及腫瘤組織勻漿中菌落數(shù)較口服后第2天明顯增多,并且發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的菌落數(shù)增加更明顯；在口服后第7天,肝臟、脾臟組織勻漿中菌落生長明顯減少,而腫瘤組織中菌落大量生長；同時冰凍切片熒光顯示同樣的結(jié)果。說明了減毒沙門菌能特異性地聚集于

10、腫瘤組織中。
　　 第二章 口服mtHSP70/HSV-TK重組沙門菌對小鼠黑色素瘤的抑制作用
　　 1.目的:
　　 研究以減毒沙門菌SL7207為載體的結(jié)核桿菌熱休克蛋白70(mtHSP70)和人單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)雙基因共表達的DNA疫苗靶向治療小鼠黑色素瘤的效應(yīng),以及該疫苗抗腫瘤的可能機制。
　　 2.方法:
　　 將本課題組前期已制備并通過鑒定的重組沙門菌:SL7207

11、/PCMV-mtHSP70-IRES-TK、SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP、SL7207/PCMV-TK-IRES-EGFP、SL7207/PCMV-IRES-EGFP復(fù)蘇,制備成以減毒沙門菌SL7207為載體的口服DNA疫苗。將細胞濃度為107/ml的小鼠黑色素瘤細胞B16細胞0.1 ml接種于C57BL/6J小鼠右背皮下,建立小鼠黑色素瘤B16動物模型,當腫瘤體積達到100 mm3左右,將荷瘤小鼠C57B

12、L/6J隨機分成五組,每組10只,實驗組及對照組口服(灌胃法)109CFU/ml的重組沙門菌100 μl,qd×2天,第一次口服48 h后,輔以HSV-TK基因前體藥物GCV 50mg/Kg,腹腔注射,Bid×5天,此為一周期,共治療三周期。同時空白對照組給予100 μl PBS灌胃,同樣給予GCV。治療期間每三天測量荷B16小鼠瘤體大小,觀察各組小鼠瘤體變化情況,并計算抑瘤率；最后一次治療結(jié)束時每組隨機處死5只,剩下的荷瘤鼠用于觀察生

13、存期。用HE染色、免疫熒光學(xué)檢測腫瘤組織及其周圍免疫細胞的變化；在無菌狀態(tài)下取得免疫鼠脾臟,用LDH釋放法檢測CTL及NK的活性；制備脾細胞上清用Elisa法檢測IFN-γ的含量。
　　 3.結(jié)果:
　　 五組B16黑色素瘤小鼠經(jīng)重組沙門菌治療三個周期后,①用重復(fù)測量方法對各組腫瘤體積進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示五組間差異有顯著性(F=599.949,P=0.000),不同重組菌處理組與時間之間有交互作用(F=331.643,

14、P=0.000),HT組分別與各對照組腫瘤體積差異有顯著性(P=0.000)；H組及T組與Sa組、PBS組腫瘤體積差異有顯著性(P=0.000),H組與T組腫瘤體積差異無顯著性(P=0.398),Sa組與PBS組腫瘤體積差異有顯著性(P=0.000)；相對PBS組,各重組沙門菌組在第三個療程治療結(jié)束的抑瘤率分別是:HT組抑瘤率為78.47％,H組抑瘤率為63.02％,T組抑瘤率為61.63％,Sa組抑瘤率為55.61％。②以Log-Ra

15、nk法行生存分析,結(jié)果表明中位生存時間:HT組為35.60天,H組為31.17天,T組為31.50天,Sa組為29.73天,PBS組為27.53天；5組間生存期存在差異(x2=12.591,P=0.013),HT組生存期顯著長于其他各組(P<0.05)。③LDH釋放法檢測結(jié)果表明:在不同的效靶比情況下5組間CTL殺傷活性差異有顯著性意義(x2=11.867,P=0.018),HT組、H組、T組、Sa組、PBS組的秩次分別是:13.07、

16、10.33、8.33、5.67、2.00,不同效靶比之間CTL殺傷活性差異無顯著性意義(x2=1.820,P=0.403)；5組間NK殺傷活性差異無顯著性意義(x2=7.121,P=0.130),不同效靶比之間差異有顯著性(x2=6.316,P=0.043),效靶比為50:1、25:1和12.5:1時的殺傷活性的秩次分別為:11.60、7.90、4.50。④Elisa法檢測治療后各組荷瘤小鼠脾細胞上清IFN-γ的含量結(jié)果顯示:組間不符合

17、方差齊性,故用welch方法檢驗:組間總體比較差異有顯著性(F=54.441,P=0.000),進一步用Dunnett T3進行兩兩比較:HT組、H組、T組與PBS組之間差異有顯著性(P<0.05),HT組、H組、T組、Sa組組間差異沒有顯著性(P>0.05)。⑤HE染色及免疫熒光法檢測結(jié)果表明:通過重組菌治療后獲得免疫的荷瘤小鼠的腫痛組織明顯地壞死,腫瘤組織內(nèi)及其周圍炎癥細胞、CD8+T淋巴細胞浸潤明顯。
　　 全文結(jié)論: