乙肝病毒核心蛋白對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達的調(diào)控作用及其分子機制研究.pdf

1、研究目的:
　　 1.研究乙肝病毒核心蛋白(HepatitisBviruscoreprotein，HBc)對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(HumanTelomeraseReverseTranscriptase,hTERT)表達的調(diào)控作用。
　　 2.驗證hTERT在HBc調(diào)控肝癌細胞生長、增殖中的關(guān)鍵作用。
　　 3.探討乙肝病毒核心蛋白HBc調(diào)控hTERT表達的分子機制。
　　 研究方法:
　　 1.HBc

2、蛋白影響肝癌細胞生長的體內(nèi)試驗研究
　　 課題組前期試驗結(jié)果顯示，HBc可在體外增強肝癌細胞的生長及克隆增殖能力。本論文在此研究基礎上，利用裸鼠皮下成瘤模型在體內(nèi)進一步驗證該現(xiàn)象。將HepG2.2.15細胞（1×107個/0.2ml）皮下接種裸鼠，經(jīng)10d左右腫瘤直徑達0.5cm。將成瘤小鼠隨機分為兩組，每隔3d分別注射2ugpshRNA-HBc質(zhì)粒和pshRNA-NC質(zhì)粒，每隔1d測量腫瘤直徑大小，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲

3、線。2w后，處死裸鼠，取出瘤體，稱量瘤重。同時，提取腫瘤組織總RNA，RT-PCR檢測hTERT和HBcmRNA的表達情況。
　　 2.HBc蛋白對hTERT基因表達的調(diào)控作用
　　 2.1HBc蛋白對hTERT表達的影響
　　 課題組前期實驗結(jié)果顯示，HBc可以促進BEL7402細胞中hTERTmRNA的表達，同時pshRNA-HBc亦可抑制HepG2.2.15細胞中hTERTmRNA的表達。本論文在此基礎上，

4、將pcDNA3-HBc-HA質(zhì)粒和pcDNA3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BEL7402、Hela以及HepG2細胞中，培養(yǎng)48h后提取總蛋白，WesternBlot檢測hTERT的蛋白的表達情況。同時為了進一步檢測hTERT的表達定位情況，我們在Hela細胞中分別轉(zhuǎn)入pcDNA3-HBc-HA質(zhì)粒和pcDNA3質(zhì)粒，48h后進行免疫熒光實驗，使用熒光抗體標記hTERT蛋白，DAPI染核后利用熒光顯微鏡觀察hTERT的表達及定位情況。
　　 2

5、.2肝細胞肝癌組織標本中HBc與hTERT表達的相關(guān)性分析
　　 上述細胞試驗完成后，我們又選取了16例肝細胞肝癌(HepatoCellularCarcinoma,HCC)組織標本，分別提取各樣本的RNA和蛋白質(zhì)，RT-PCR檢測每例標本中HBc表達情況后，將各組織標本分為HBc陽性和HBc陰性兩組。利用WesternBlot比較這兩組標本中hTERT蛋白的表達情況，光密度掃描分析蛋白表達強度，最后繪制散點圖，統(tǒng)計學分析兩組標本

6、中hTERT蛋白表達的差異。
　　 3.hTERT在HBc促進肝癌細胞生長中的作用
　　 為了進一步研究HBc，hTERT和細胞增長之間的關(guān)系，我們將hTERT-si或NC-si與pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表達載體共轉(zhuǎn)染至BEL7402細胞中，繪制生長曲線并進行克隆形成試驗，檢測BEL7402細胞的生長、增殖情況。另一方面，將hTERT-si或NC-si與HBc干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HepG2.2.15細胞，繪制

7、生長曲線并進行克隆形成試驗，檢測HepG2.2.15細胞生長、增殖情況，反向驗證hTERT在HBc促進肝癌細胞生長中的作用。
　　 4.HBc對hTERT啟動子活性的調(diào)控機制研究
　　 4.1HBc對hTERT核心啟動子的調(diào)控作用
　　 為了明確HBc影響hTERT表達的機制，將pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表達載體與攜帶有hTERT核心啟動子的報告基因質(zhì)粒pGL3B-hTERT371分別共轉(zhuǎn)染至BEL

8、7402，HepG2細胞，同時轉(zhuǎn)染pRL-TK作為內(nèi)參質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24h后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品熒光強度，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。另一方面，將pshRNA-HBc或pshRNA-NC與攜帶有hTERI核心啟動子的報告基因質(zhì)粒pGL3B-hTERT371，以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，轉(zhuǎn)染24h后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品熒光強度，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，反向驗證HBc對hTERT核心啟

9、動子的調(diào)控作用。
　　 4.2HBc調(diào)節(jié)hTERT啟動子活性關(guān)鍵區(qū)域的尋找
　　 為進一步明確HBc調(diào)節(jié)hTERT啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域，將pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表達載體與一系列截短缺失的hTERT啟動子報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至BEL7402和HepG2細胞。轉(zhuǎn)染24h后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品熒光強度。另一方面，利用pshRNA-HBc封閉HBc的表達后，將一系列截短缺失

10、的hTERT啟動子報告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至HepG2.2.15細胞。轉(zhuǎn)染24h后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品的熒光強度。
　　 4.3HBc調(diào)節(jié)hTERT啟動子活性關(guān)鍵位點的尋找
　　 明確HBc影響hTERT啟動子活性的關(guān)鍵區(qū)域后，我們通過相應的文獻1分析了關(guān)鍵區(qū)域中包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，其中包括c-Ets-2的結(jié)合位點。結(jié)合相關(guān)的文獻2，轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2在調(diào)控和維持hTERT基因啟

11、動子的活性中發(fā)揮重要作用。因此，我們設計并構(gòu)建了c-Ets-2結(jié)合位點突變的hTERT核心啟動子報告基因載體，將pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表達載體與c-Ets-2結(jié)合位點突變或野生型hTERT核心啟動子報告基因載體，以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK分別共轉(zhuǎn)染BEL7402細胞，轉(zhuǎn)染24h后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品熒光強度。另一方面，將pshRNA-HBc或pshRNA-NC與c-Ets-2結(jié)合位點突變或野生型hTER

12、T核心啟動子報告基因載體，以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，轉(zhuǎn)染24h后裂解細胞，利用96孔化學發(fā)光儀檢測樣品的熒光強度。
　　 5.c-Ets-2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBc調(diào)控hTERT表達中的作用研究
　　 5.1HBc對c-Ets-2蛋白核轉(zhuǎn)位的影響
　　 結(jié)合文獻報道3，c-Ets-2蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用依賴于其從胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位過程。因此，我們將pcDNA3-HBc-HA或pcD

13、NA3表達載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，轉(zhuǎn)染24h后，分別提取兩組細胞的胞核蛋白和胞漿蛋白，通過WesternBlot檢測c-Ets-2蛋白在胞質(zhì)、胞核中的表達變化，明確HBc是否影響c-Ets-2蛋白的核轉(zhuǎn)位。
　　 5.2HCC組織標本中HBc表達與c-Ets-2蛋白細胞定位的相關(guān)性分析
　　 在細胞實驗的基礎上，我們又提取了上述HCC組織標本的胞漿、胞核蛋白，WesternBlot檢測HBc陽性和HBc陰性兩組標本中c-

14、Ets-2蛋白的細胞定位情況，光密度掃描分析蛋白表達強度，最后做出散點圖進行統(tǒng)計學相關(guān)性分析。
　　 5.3c-Ets-2在HBc調(diào)控hTERT基因表達中的作用
　　 為了進一步驗證c-Ets-2在HBc調(diào)節(jié)hTERT表達中的關(guān)鍵作用，我們將pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表達載體與c-Ets-2-si或NC-si分別共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，24h后提取RNA，RT-PCR檢測hTERT基因mRNA的表達情況。

15、r>　　 5.4HBc對ERK通路活化的影響
　　 已有文獻報道3，ERK信號通路的活化可磷酸化c-Ets-2蛋白，進而促進其核轉(zhuǎn)位過程。因此，我們將pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表達載體分別轉(zhuǎn)染Hela和HepG2細胞，24h、36h和48h后提取細胞總蛋白，WesternBlot檢測p-ERK1/2的表達情況，驗證HBc是否影響ERK信號通路的活化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.HBc蛋白可促進肝

16、癌細胞的體內(nèi)生長
　　 在裸鼠成瘤實驗中，檢測裸鼠體內(nèi)腫瘤體積大小和瘤重等指標，結(jié)果顯示pshRNA-HBc注射組的腫瘤的體積和瘤重均明顯小于pshRNA-NC質(zhì)粒注射組（P＜0.05）。RT-PCR顯示pshRNA-HBc注射組腫瘤組織中hTERT的mRNA表達量明顯低于對照組。
　　 2.HBc可上調(diào)hTERT蛋白的表達
　　 2.1HBc可上調(diào)肝癌細胞系中hTERT蛋白的表達
　　 將pcDNA3-

17、HBc-HA或pcDNA3表達載體轉(zhuǎn)染至BEL7402，Hela，HepG2細胞，WesternBlot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBc表達載體組細胞hTERT蛋白表達量顯著高于轉(zhuǎn)染空載體組（P＜0.05）。同時免疫熒光結(jié)果顯示，hTERT蛋白主要定位于細胞核內(nèi)，過表達HBc可以顯著提高Hela細胞中hTERT蛋白的表達。
　　 2.2HBc陽性肝癌組織中hTERT蛋白的表達顯著升高
　　 選取16例HCC組織標本，分別提取各樣本的

18、RNA和蛋白質(zhì)，通過RT-PCR將各組織標本分為6例HBc陰性標本和10例HBc陽性標本。WesternBlot檢測hTERT蛋白的表達，結(jié)果蛋白條帶進行光密度掃描，計算相對表達量hTERT/β-actin，統(tǒng)計學分析顯示HBc陽性HCC標本中hTERT蛋白表達水平顯著高于HBc陰性組（P＜0.05）。
　　 3.hTERT在HBc促進肝癌細胞生長中發(fā)揮重要作用
　　 生長曲線和克隆形成試驗的結(jié)果顯示，過表達HBc可以增

19、強BEL7402細胞的生長和克隆形成能力（P＜0.05），但hTERT-si的轉(zhuǎn)入使細胞生長顯著受抑制，且可逆轉(zhuǎn)HBc對細胞生長和克隆增殖的促進作用(P＞0.05)。另一方面，小干擾RNA封閉HBc的表達后HepG2.2.15細胞的增殖和克隆形成率受到明顯抑制（P＜0.05），但hTERT-si亦可導致細胞生長速度的減慢，且可消除pshRNA-HBc和pshRNA-NC轉(zhuǎn)染組間細胞生長和克隆形成能力的差異（P＞0.05）。以上結(jié)果從正反

20、兩方面驗證了hTERT在HBc促進肝癌細胞生長、增殖過程中發(fā)揮重要作用。
　　 4.HBc對hTERT啟動子活性的調(diào)控機制研究
　　 4.1HBc蛋白上調(diào)hTERT核心啟動子的活性
　　 共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測結(jié)果顯示，在BEL7402細胞中，隨著HBc蛋白表達量的升高，hTERT核心啟動子的活性被顯著上調(diào)（P＜0.001），且具有明顯劑量依賴性;HepG2細胞中，轉(zhuǎn)染HBc組hTERT核心啟動子的活性亦明顯高于轉(zhuǎn)染

21、空載體組（P＜0.05）。另一方面，在HepG2.2.15細胞中，小干擾RNA封閉HBc的表達可明顯下調(diào)hTERT核心啟動子的活性（P＜0.05）。以上結(jié)果顯示，HBc可上調(diào)hTERT核心啟動子的活性。
　　 4.2hTERT啟動子-130～-197bp區(qū)域是HBc發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵區(qū)段
　　 共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測結(jié)果顯示，HBc的過表達可以上調(diào)BEL7402和HepG2細胞中pGL3B-hTERT371，pGL3B-hT

22、ERT306，pGL3B-hTERT197啟動子報告基因的活性（P＜0.05），而HBc對pGL3B-hTERT130啟動子的活性無明顯影響;另一方面，小干擾RNA封閉HBc的表達可顯著降低HepG2.2.15細胞中pGL3B-hTERT371，pGL3B-hTERT306，pGL3B-hTERT197啟動子報告基因的活性，而不影響pGL3B-hTERT130啟動子的活性。以上結(jié)果表明，HBc可能通過hTERT啟動子-130～-197b

23、p區(qū)域來促進hTERT基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 4.3轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2結(jié)合位點是HBc激活hTERT啟動子的關(guān)鍵位點
　　 相關(guān)文獻報道1，在-130～-197bp區(qū)域內(nèi)存在著c-Ets-2，bHLH2，AP-2，NF-E2/AP2四個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。鑒于轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2在維持hTERT轉(zhuǎn)錄活性中的關(guān)鍵作用，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2結(jié)合位點突變的hTERT核心啟動子報告質(zhì)粒pGL3B-c-EtsMUT。將

24、pGL3B-c-EtsMUT或野生型pGL3B-hTERT371啟動子報告基因載體與pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表達載體分別共轉(zhuǎn)染BEL7402細胞。轉(zhuǎn)染24h后提取蛋白，雙熒光檢測結(jié)果顯示，HBc的過表達明顯上調(diào)野生型pGL3B-hTERT371啟動子報告基因的活性(P＜0.05)，而對pGL3B-c-EtsMUT啟動子報告基因的活性無明顯影響。另一方面，在HepG2.2.15細胞中，將pshRNA-HBc或pshRNA-

25、NC與pGL3B-c-EtsMUT或野生型pGL3B-hTERT371啟動子報告基因載體共轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，轉(zhuǎn)染24h后裂解細胞，雙熒光檢測結(jié)果顯示，小干擾RNA封閉HBc的表達明顯抑制野生型pGL3B-hTERT371啟動子報告基因的活性(P＜0.05)，而不影響c-Ets-2結(jié)合位點突變的pGL3B-c-EtsMUT啟動子的活性。以上結(jié)果提示，轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2結(jié)合位點為HBc調(diào)控hTERT啟動子活性的關(guān)鍵位點。

26、r>　　 5.c-Ets-2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBc調(diào)控hTERT表達中發(fā)揮重要作用
　　 5.1HBc可促進肝癌細胞中c-Ets-2蛋白的核轉(zhuǎn)位
　　 WesternBlot結(jié)果顯示，HepG2細胞中HBc的過表達可以使c-Ets-2蛋白的胞核表達水平顯著升高，而胞漿表達降低。該結(jié)果提示HBc可促進細胞中c-Ets-2蛋白的核轉(zhuǎn)位。
　　 5.2HBc陽性HCC組織中胞核c-Ets-2蛋白的表達略有升高

27、
　　 WesternBlot檢測HCC組織中c-Ets-2蛋白的胞核表達，條帶進行光密度掃描，計算相對表達量c-Ets-2/LaminA/C，結(jié)果顯示，HBc陽性HCC組織胞核c-Ets-2蛋白的表達水平略高于HBc陰性HCC組織，但統(tǒng)計學分析未見顯著性差異（P＞0.05）。
　　 5.3c-Ets-2蛋白在HBc調(diào)控hTERT基因表達中發(fā)揮關(guān)鍵作用
　　 在HepG2細胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3-HBc-HA或p

28、cDNA3與c-Ets-2-si，RT-PCR結(jié)果顯示，與NC-si轉(zhuǎn)染組相比，c-Ets-2-si可顯著下調(diào)hTERTmRNA的表達水平，且可消除pcDNA-HBc-HA對hTERT表達的上調(diào)作用。
　　 5.4HBc蛋白可促進ERK通路的活化
　　 WesternBlot結(jié)果顯示，在Hela細胞中，與對照組相比，pcDNA3-HBc轉(zhuǎn)染后36h、48h即可促進p-ERK1/2的表達，同時hTERT蛋白的表達亦被明顯上

29、調(diào);在HepG2細胞中，HBc蛋白亦可以促進p-ERK1/2的表達。結(jié)合文獻，以上結(jié)果提示ERK通路的活化可能參與了HBc對hTERT蛋白表達和c-Ets-2蛋白核轉(zhuǎn)位的調(diào)控作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.HBc蛋白可促進肝癌細胞在體內(nèi)的生長。
　　 2.HBc可劑量依賴性地上調(diào)hTERT蛋白的表達，且hTERT在HBc促進肝癌細胞生長中發(fā)揮重要作用。
　　 3.HBc蛋白可上調(diào)hTERT啟動子的活性，且

30、轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2結(jié)合位點是HBc發(fā)揮調(diào)控作用的的關(guān)鍵位點。
　　 4.c-Ets-2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBc調(diào)控hTERT表達中發(fā)揮著重要的作用。
　　 意義:
　　 1.該課題第一次提出了HBc對hTERT表達的調(diào)控作用，驗證了hTERT在HBc調(diào)控肝癌細胞生長、增殖中的關(guān)鍵作用，為揭示HBc參與肝癌發(fā)生的分子機制提供了直接的實驗依據(jù)。
　　 2.首次對HBc調(diào)控hTERT表達的分子機制進行