缺氧對人乳腺癌細(xì)胞微球體培養(yǎng)與生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了詳細(xì)闡述。
　　第一部分缺氧對人乳腺癌細(xì)胞微球體培養(yǎng)的影響.
　　目的：研究缺氧對人乳腺癌細(xì)胞微球體(mammospheres，MSs)培養(yǎng)速率及效率的影響，以探討優(yōu)化乳腺癌干細(xì)胞富集方法的可能途徑。
　　方法;分別在缺氧及常氧狀態(tài)下對經(jīng)化療后的人乳腺癌組織細(xì)胞進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，并觀察記錄其成球速率。利用流式細(xì)胞檢測技術(shù)分別檢測缺氧組與常氧組MSs及MDA-MB-231細(xì)胞中CD44+CD24-

2、/Low表型細(xì)胞比例。Western blotting檢測三組細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞分子標(biāo)記物CD44、CD24及ALDH1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:缺氧組MSs無論成球速率還是球體直徑均優(yōu)于常氧組MSs，P＜0.05。流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)缺氧組MSs中CD44+CD24-/Low表型細(xì)胞比例為82.35±6.28％，高于常氧組MSs的1.17±0.05％，P＜0.05。Westernblotting檢測提示缺氧組MSs中CD44與ALDH

3、1的表達(dá)量顯著高于常氧組MSs與MDA-MB-231細(xì)胞。缺氧組MSs中CD24表達(dá)量與常氧組MSs及MDA-MB-231細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。
　　結(jié)論:缺氧狀態(tài)可以提高M(jìn)Ss無血清懸浮培養(yǎng)速率，且增加MSs中表達(dá)乳腺癌干細(xì)胞特定分子標(biāo)記物細(xì)胞的比例。缺氧與無血清懸浮非粘附培養(yǎng)MSs相結(jié)合的方法可用于乳腺癌干細(xì)胞的分選。
　　第二部分缺氧對人乳腺癌細(xì)胞微球體遷移、侵襲與動物成瘤特性的影響及相關(guān)機(jī)制初探。
　

4、　目的:研究缺氧對人乳腺癌細(xì)胞微球體(mammospheres，MSs)遷徙、侵襲及動物成瘤能力的影響，并對其發(fā)生機(jī)制做初步探討。
　　方法:利用細(xì)胞劃痕、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測缺氧組人乳腺癌細(xì)胞微球體細(xì)胞(mammospheres-derived cells，MSDCs)與常氧組MSDCs遷徙、侵襲能力之間的差異。通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)缺氧組與常氧組MSDCs在裸鼠體內(nèi)的成瘤情況，并記錄移植瘤成瘤時間與瘤體體積。免疫組織化學(xué)檢

5、測缺氧組及常氧組移植瘤組織中HIF-2α、ABCG2的表達(dá)。Western blotting及RT-PCR定量檢測缺氧組MSDCs、常氧組MSDCs與MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-2α、ABCG2與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)標(biāo)記物E-Cadherin、Twist、Vimentin、N-Cadherin的表達(dá)情況。Western blotting及Real time

6、RT-PCR檢測缺氧組、常氧組裸鼠移植瘤及瘤旁組織中VEGF與EGF的表達(dá)。
　　結(jié)果:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)48h后缺氧組MSDCs的修復(fù)指數(shù)92.52±9.36％高于常氧組MSDCs修復(fù)指數(shù)31.75±6.21％，P＜0.05。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示缺氧組MSDCs穿膜細(xì)胞數(shù)達(dá)到76.24±10.35，而常氧組MSDCs穿膜細(xì)胞為27.38±8.18個，P＜0.05。缺氧組MSDCs在裸鼠體內(nèi)成瘤速度及移植瘤體積均強(qiáng)于常氧組MS

7、DCs，P＜0.05。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)缺氧組移植瘤組織中HIF-2α與ABCG2表達(dá)強(qiáng)于常氧組移植瘤。Western blotting及Real time RT-PCR檢測結(jié)果提示:缺氧組MSDCs中HIF-2α、ABCG2、Twist、Vimentin、N-Cadherin表達(dá)量高于常氧組MSDCs及MDA-MB-231細(xì)胞，P＜0.05。缺氧組MSDCs及常氧組MSDCs中E-Cadherin均低表達(dá)，且兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞

8、0.05。缺氧組移植瘤中VEGF、EGF表達(dá)高于常氧組移植瘤與瘤旁組織，P＜0.05。
　　結(jié)論:缺氧狀態(tài)提高M(jìn)Ss的遷徙、侵襲及動物成瘤能力，并且推測其可能機(jī)制為缺氧促進(jìn)MSs中HIF-2α活化，然后誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并上調(diào)VEGF、EGF的表達(dá)，從而改變MSs相關(guān)生物學(xué)特性。
　　第三部分ABCG2慢病毒過表達(dá)載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。
　　目的:構(gòu)建ABCG2過表達(dá)慢病毒載體，并建立人乳腺癌

9、MDA-MB-231細(xì)胞ABCG2過表達(dá)模型。
　　方法:應(yīng)用ABCG2過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，計(jì)算其轉(zhuǎn)染效率。并通過Western blotting技術(shù)檢測經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞在經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，其中ABCG2蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建ABCG2過表達(dá)慢病毒載體，在MDA-MB-231細(xì)胞中其轉(zhuǎn)染效率為95.6±3.5％。傳代培養(yǎng)后的慢病毒轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細(xì)胞中A

10、BCG2蛋白表達(dá)量高于對照組MDA-MB-231細(xì)胞，P＜0.05。
　　結(jié)論:ABCG2過表達(dá)慢病毒載體能有效轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)。
　　第四部分缺氧對人乳腺癌細(xì)胞微球體化療耐藥性的影響及其機(jī)制研究。
　　目的:探討缺氧對人乳腺癌細(xì)胞微球體(MSs)化療耐藥性的影響及其相關(guān)機(jī)制初步研究，為乳腺癌干細(xì)胞化療耐藥性相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:分別在常氧及缺氧條件下對人乳腺癌MDA-

11、MB-231細(xì)胞進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，并觀察MSs的生長速率及體積變化。MTT比色法檢測缺氧組與常氧組人乳腺癌微球體細(xì)胞(mammospheres-derivedcells，MSDCs)及ABCG2過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染組與對照組MDA-MB-231細(xì)胞在不同濃度、不同藥物作用下的存活率(survive Rate，SR)變化。免疫熒光化學(xué)法檢測HIF-2α、ABCG2在各組MSDCs中的表達(dá)。Westernblotting檢測ABCG2蛋白在缺

12、氧組MSDCs與病毒轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)。Westem blotting及Real-time RT-PCR檢測HIF-2α、ABCG2、P-gp及MDR1在各組MSDCs中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:缺氧組MSs生長速率及球體體積優(yōu)于常氧組。缺氧組MSDCs與慢病毒轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細(xì)胞在化療藥物作用后的生存率下降趨勢相近，在藥物濃度較低時無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。缺氧組MSDCs在化療藥物作用后的生存率下

13、降趨勢低于常氧組MSDCs與對照組MDA-MB-231細(xì)胞，P＜0.05。免疫熒光化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)HIF-2α及ABCG2在缺氧組MSDCs中的表達(dá)強(qiáng)于常氧組。缺氧組MSDCs中HIF-2α、ABCG2及P-gP蛋白表達(dá)量均高于在常氧組MSDCs及MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)，P＜0.05。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)ABCG2蛋白在缺氧組MSDCs與慢病毒轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細(xì)胞組中表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。R