Calbindin-D9k與甲氧滴滴涕抗小鼠著床的相關性研究.pdf

1、當前，環(huán)境雌激素的危害問題已引起人們極大的關注。許多研究證實，環(huán)境雌激素對動物具有內分泌干擾效應，能明顯降低生殖功能[1,2]。
　　甲氧滴滴涕（MXC）是一種替代滴滴涕的有機氯殺蟲劑，在體內可被轉化為具有雌激素活性的代謝物[3]。被廣泛用于殺滅農作物和室內的害蟲。與DDT相比，MXC具有毒性低、代謝快、在脂肪組織中不易蓄積等優(yōu)點[4]。然而研究表明，MXC對動物的生育具有毒性作用，包括阻止胚胎著床[5,6,7]，但MXC抑制胚胎

2、著床的機制尚待深入研究。
　　鈣結合蛋白D9k（Calbindin-D9k）是一種分子量為9kD的鈣結合蛋白，屬于細胞內的蛋白家族。子宮Calbindin-D9k因與細胞內的鈣水平密切相關，認為其可控制子宮肌層的活動[8]。此外，有證據表明，在胚胎植入的早期階段必需有Calbindin-D9k的存在，它對胚胎的成功植入發(fā)揮至關重要的作用[9]。
　　研究發(fā)現，未成熟雌性大鼠體內暴露環(huán)境雌激素，如MXC，可引起子宮Calbin

3、din-D9k的表達顯著上升，并呈劑量依賴關系，因此Calbindin-D9k可被用作檢測環(huán)境雌激素類化學物雌激素活性的生物標志物，然而，有關MXC對胚胎著床期Calbindin-D9k表達的影響的研究十分缺乏。
　　本課題的目的是通過使用MXC染毒孕小鼠作為實驗動物模型，探討MXC對孕小鼠子宮雌激素受體α亞型(ERα)、孕激素受體（PR）表達的影響以及對小鼠妊娠率及胚胎著床數的影響。同時，進一步深入研究MXC染毒對孕小鼠子宮Ca

4、lbindin-D9kmRNA和蛋白表達的影響，揭示MXC抑制胚胎著床的分子機制。
　　本實驗分為兩個部分。
　　第一部分：構建MXC染毒孕小鼠模型，觀察MXC對胚胎著床及子宮ERα、PR表達的影響。
　　八十只交配成功的雌小鼠被隨機分配到4個組，每組20只。其中3個MXC處理組小鼠從孕1d（發(fā)現陰栓定為孕0d）起給予MXC灌胃染毒，每天1次，連續(xù)3d，劑量分別為低劑量組(100mg/kg),中劑量組(200mg/kg

5、),高劑量組(400mg/kg),MXC溶解在芝麻油中給藥。對照組小鼠只灌芝麻油溶劑。至孕5d處死孕鼠，迅速分離出子宮并觀察各組小鼠妊娠率及胚胎著床數。采用RT-PCR檢測子宮ERα、PRmRNA表達，免疫組織化學與圖像分析技術檢測子宮ERα、PR蛋白表達。
　　結果：①孕小鼠經MXC灌胃3d后，高、中劑量MXC組孕小鼠的妊娠率與對照組相比顯著降低(P<0.05)，低劑量MXC組孕小鼠的妊娠率與對照組相比降低無明顯差異；②高、中劑

6、量MXC組孕小鼠平均胚胎著床數與對照組相比顯著降低(P<0.01)，然而，低劑量組孕小鼠胚胎著床數雖然有所降低，但無統(tǒng)計學意義。③隨著MXC染毒劑量的增加，孕小鼠子宮ERαmRNA與蛋白的表達量相應增加，高、中劑量組ERαmRNA與蛋白的表達與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；④高、中劑量組孕小鼠子宮PRmRNA的表達較對照組顯著降低(P<0.05)，低劑量組PRmRNA的表達未見明顯變化，PR蛋白表達的變化與PRmRNA

7、的變化一致。
　　第二部分：MXC對孕早期小鼠子宮Calbindin-D9k基因表達的影響
　　實驗動物染毒模型構建同實驗一。采用RT-PCR檢測Calbindin-D9kmRNA表達，Westernblot和免疫組化染色法檢測Calbindin-D9k蛋白表達。結果：當孕鼠暴露MXC3d后，高、中劑量組Calbindin-D9kmRNA的表達量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，然而，低劑量組Calbindin-D9km

8、RNA的表達與對照組相比降低不明顯(P>0.05)。Calbindin-D9k蛋白在孕5d主要表達在子宮內膜上皮細胞和腺上皮細胞。與mRNA的表達水平相應，高、中劑量組Calbindin-D9k蛋白的表達量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，而低劑量組與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。
　　結論：綜合以上結果，我們得出如下結論：
　　①MXC染毒可明顯降低孕小鼠的妊娠率及胚胎著床數，抑制胚胎著床作用與MXC染毒劑量呈

9、正相關性。
　?、贛XC通過其弱雌激素活性和拮抗孕激素作用，上調孕小鼠子宮ERαmRNA及蛋白表達，同時下調PRmRNA及蛋白表達，說明MXC可干擾孕小鼠體內雌、孕激素正常環(huán)境，抑制胚胎著床。
　　③胚胎著床早期Calbindin-D9k參與調節(jié)著床點鈣的利用及控制子宮肌層的活動，對胚胎穩(wěn)定著床發(fā)揮重要作用。MXC染毒降低著床期孕小鼠子宮Calbindin-D9kmRNA及蛋白表達，其下調水平與MXC染毒劑量呈正相關性。