MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控苯并(a)芘和滴滴涕聯(lián)合暴露致DNA損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　苯并(a)芘(benzo[a]pyrene，BaP)是多環(huán)芳烴類化合物的典型代表之一，于各種環(huán)境介質(zhì)中廣泛存在，具有很強(qiáng)的致癌性，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為1類致癌物。滴滴涕(2，2-bis(4-chlorophenyl)-1，1，1-trichloroethane，DDT)曾是生產(chǎn)及使用范圍最廣的一類有機(jī)氯農(nóng)藥，在環(huán)境中非常難于降解，具有高親脂性，可以對(duì)哺乳動(dòng)物的肝臟、腎臟、神經(jīng)等系統(tǒng)造成損害。BaP和DDT常共存于環(huán)境

2、并可通過食物鏈的生物放大作用富集于人體，危害人類健康。因此，探討二者聯(lián)合暴露對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)及機(jī)制，不僅可以揭示二者聯(lián)合效應(yīng)的作用模式，更為評(píng)估多種污染物聯(lián)合暴露的生態(tài)安全性提供科學(xué)依據(jù)，具較好的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　方法:
　　以遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)研究中常用的HepG2細(xì)胞株為研究對(duì)象，以DNA損傷早期出現(xiàn)的組蛋白H2AX磷酸化焦點(diǎn)γH2AX(gamma-H2AX)的形成為效應(yīng)指標(biāo)，設(shè)0.1％二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對(duì)

3、照組，12.5、25、50μmol/L BaP和0.1、1、10μmol/L DDT為處理組。單獨(dú)暴露組為上述濃度的BaP或DDT分別作用24h;聯(lián)合暴露組為0.1、1或10μmol/L的DDT處理HepG2細(xì)胞24h后，再分別加入12.5、25或50μmol/L的BaP作用24h。采用免疫熒光及westernblot法分析單獨(dú)及聯(lián)合暴露組γH2AX焦點(diǎn)及蛋白的表達(dá)量，明確二者聯(lián)合作用的毒效應(yīng)類型。針對(duì)具有明確聯(lián)合毒效應(yīng)的組別:采用we

4、stern blot法檢測(cè)磷酸化蛋白p-p38、p-ERK和p-JNK的表達(dá)，揭示絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的三條經(jīng)典信號(hào)通路:c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracelluar signal-regulated kinase，ERK)通路和/或P38MAPK通路的活化情況;采用細(xì)胞色

5、素P4501A(cytochromeP4501A，CYP4501A)抑制劑α-萘黃酮(α-Naphthoflavone，ANF)預(yù)處理1h后，檢測(cè)γH2AX、CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1蛋白的表達(dá)，找到參與BaP和DDT聯(lián)合暴露致DNA損傷效應(yīng)的CYPP450酶;采用MAPK通路抑制劑SB203580和PD98059處理30min后，檢測(cè)γH2AX、CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1蛋白的表達(dá)，探討B(tài)aP和DDT聯(lián)合暴

6、露致HepG2細(xì)胞DNA損傷的MAPK信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　(1) BaP和DDT單獨(dú)誘導(dǎo)DNA損傷的劑量效應(yīng)關(guān)系:BaP和DDT均可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生γH2AX。與溶劑對(duì)照組相比，BaP處理組隨著染毒劑量升高(12.5、25、50μmol/L)，γH2AX表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DDT處理組未發(fā)現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　(2) BaP和DDT聯(lián)合誘導(dǎo)DNA損傷的效應(yīng)類型:免疫熒光結(jié)

7、果經(jīng)2因素3水平析因設(shè)計(jì)方差分析得出:BaP和DDT間存在聯(lián)合效應(yīng)(F=5.070，P＜0.001)。其中，具有協(xié)同作用的組為:0.1μmol/L DDT+12.5μmol/L BaP;具有拮抗作用的組為:0.1μmol/L DDT+50μmo l/L BaP、10μmol/L DDT+25μmol/L BaP、10μmol/L DDT+50μmol/L BaP。western blot結(jié)果經(jīng)2因素3水平析因設(shè)計(jì)方差分析得出，BaP和D

8、DT間存在聯(lián)合效應(yīng)(F=13.279，P＜0.001)。其中，具有協(xié)同作用的組為:10μmol/L DDT+12.5μmol/L BaP;具有拮抗作用的組為:0.1μmol/L DDT+25μmol/L BaP、1μmol/L DDT+25μmol/L BaP、0.1μmol/LDDT+50μmol/L BaP、1μmol/L DDT+50μmol/L BaP。因此，確定具有拮抗作用的0.1μmol/L DDT+50μmol/L BaP

9、聯(lián)合暴露組進(jìn)行后續(xù)研究。
　　(3) CYP450酶參與BaP和DDT聯(lián)合暴露的DNA損傷效應(yīng):與溶劑對(duì)照組相比，50μmol/L BaP可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和γH2AX表達(dá)量升高，加入ANF處理后，CYP1A1、CYP1A2和γH2AX表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。0.1μmol/L DDT可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞 CYP1A1、CYP1B1和γH2AX表達(dá)量升高，加入AN

10、F處理后，CYP1A1、CYP1B1和γH2AX表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。0.1μmol/LDDT+50μmol/L BaP可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞CYP1A1、CYP1A2和γH2AX表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。加入ANF處理后，與0.1μmol/LDDT+50μmol/L BaP相比，CYP1A1、1A2、γH2AX表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(4) MAPK通路參與

11、調(diào)控CYP450酶介導(dǎo)的BaP和DDT聯(lián)合暴露致DNA損傷:與對(duì)照組相比，50μmol/L BaP誘導(dǎo)HepG2中p-p38、p-JNK、p-ERK表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);0.1μmol/L DDT誘導(dǎo)HepG2中p-p38和p-JNK表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);0.1μmol/L DDT+50μmol/L誘導(dǎo)HepG2中p-p38和p-ERK表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與0.1

12、μmol/L DDT+50μmol/L BaP組相比，SB203580、PD98059處理后CYP1A1、CYP1A2和γH2AX蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1) BaP和DDT均可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生γH2AX，且BaP誘導(dǎo)的γH2AX表達(dá)量隨著濃度的升高而升高;DDT組未發(fā)現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　(2) BaP和DDT聯(lián)合暴露致HepG2的細(xì)胞DNA損傷類型既可以表現(xiàn)為協(xié)同

13、作用，也可以表現(xiàn)為拮抗作用。其中，免疫熒光和western blot結(jié)果均顯示0.1μmol/L DDT+50μmol/L BaP聯(lián)合暴露組為拮抗作用。
　　(3) CYP1A1和CYP1A2參與50μmol/L BaP致HepG2細(xì)胞的DNA損傷過程。CYP1A1和CYP1B1參與0.1μmol/L DDT致HepG2細(xì)胞的DNA損傷過程。CYP1A1和CYP1A2參與0.1μmol/L DDT+50μmol/L BaP致Hep