p-Akt、survivin在乳腺癌中的表達(dá)及以此為靶向的乳腺癌放射治療增敏研究.pdf

1、乳腺癌作為一種全身性的疾病需要使用不同的干預(yù)手段進(jìn)行綜合治療，包括使用手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、生物治療、內(nèi)分泌治療等。放射治療在乳腺癌患者的局部控制中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，能降低腫瘤在乳腺、胸壁及腋窩的局部復(fù)發(fā)。同時(shí)，有局部復(fù)發(fā)高危因素的乳腺癌患者，放射治療也能提高總的生存率，降低復(fù)發(fā)率和死亡率。但乳腺癌產(chǎn)生對(duì)放射治療的抵抗耐受時(shí)，使得這一治療手段實(shí)施存在困難。對(duì)各種治療措施包括放射治療抵抗耐受的機(jī)制可能是通過在腫瘤細(xì)胞中活化磷

2、脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinosit01-3-kinase，P13K/Akt)和/，或上調(diào)survivin的表達(dá)。 本課題圍繞p-Akt和survivin在乳腺癌中的表達(dá)及放射治療后的變化情況，探討它們?cè)谌橄侔┓派渲委煹挚鼓褪苤械淖饔?。并研究通過魚藤素同時(shí)阻斷Akt信號(hào)通路和抑制survivin的表達(dá)從而達(dá)到在體外和裸鼠移植瘤模型體內(nèi)增強(qiáng)乳腺癌對(duì)放射治療的敏感性。為將來臨床應(yīng)用此策略提高乳腺癌對(duì)放射治療的敏感

3、性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分 p-Akt、survivin在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床意義 【目的】探討p-Akt、survivin在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義，用于指導(dǎo)乳腺癌的臨床治療。 【材料和方法】收集2006年6月-2 006年12月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺內(nèi)分泌外科中心手術(shù)切除的68例女性乳腺癌患者標(biāo)本，術(shù)前未接受放、化療和內(nèi)分泌治療，均有組織病理學(xué)確診。10例正常乳腺組織標(biāo)本作對(duì)照。采用SP

4、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)p-Akt、survivin、HER2、ER、PR、p53的表達(dá)，并分析p-Akt、survivin與其它各指標(biāo)的關(guān)系。 【結(jié)果】正常乳腺組織病理標(biāo)本10例，乳腺癌組織病理標(biāo)本68例。其中浸潤性導(dǎo)管癌58例，導(dǎo)管內(nèi)癌8例，小葉癌2例。病理分期(pTNM)：I期16例，Ⅱ期35，Ⅲ-Ⅳ期17例。運(yùn)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)p-Akt、survivin陽性表+達(dá)細(xì)胞均為細(xì)胞胞漿和/或胞核著色。有關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的陽性表

5、達(dá)率為：p-Akt 41.2％(28/68)；survivin 51.5％(35/68)；HER2 33.8％(23/68)；ER 58.8％(40/68)；PR 57.4％(39/68)；p53 55.9％(38/68)。正常乳腺組織中p-Akt、survivin均無表達(dá)。進(jìn)一步分析顯示，p-Akt、survivin的表達(dá)與HER2的表達(dá)呈正相關(guān)(r值分別為0.412，0.383；P值分別為0.001，0.001)；與PR的表達(dá)呈負(fù)相

6、關(guān)(r值為-0.306；P值為0.011)。p-Akt陽性表達(dá)與患者年齡無關(guān)，但與腫瘤病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況和腫瘤大小相關(guān)。survivin的陽性表達(dá)與患者年齡、腫瘤病理分期和腫瘤大小無關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況相關(guān). 【結(jié)論】p-Akt和survivin在乳腺癌組織中的活化和高表達(dá)與腫瘤的發(fā)展顯著相關(guān)，是乳腺癌患者預(yù)后不良的判斷指標(biāo)之一。p-Akt和survivin可以作為乳腺癌抗腫瘤治療的新靶標(biāo)。 第二部分放射治療對(duì)乳

7、腺癌細(xì)胞中p-Akt和survivin表達(dá)的影響及魚藤素增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞放射治療敏感性的研究 【目的】探討p-Akt和survivin在乳腺癌放射治療抵抗耐受及以此為靶標(biāo)魚藤素放射治療增敏中的作用，為未來的臨床研究尋找有用的分子標(biāo)記物。 【材料和方法】使用Y射線照射或魚藤素及兩者聯(lián)合處理人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。采用MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)；用Westernblot方法檢測(cè)Akt、phospho-Ser47

8、3-Akt、survivin、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況；克隆源細(xì)胞檢測(cè)測(cè)定細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。 【結(jié)果】魚藤素對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞生長抑制作用具有時(shí)效和量效關(guān)系。不同劑量的Y射線照射對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞生長抑制率不同，3Gy的Y射線照射48h抑制率為(38±4)％，4Gy的Y射線照射抑制率為(56±7)％。Y射線照射與魚藤素聯(lián)合使用的細(xì)胞生長抑制率明顯高于Y

9、射線照射單獨(dú)使用的細(xì)胞生長抑制率(P<0.01)。3Gy的Y射線與10nmol/L魚藤素聯(lián)合對(duì)細(xì)胞生長抑制有協(xié)同效應(yīng)。10nmol/L魚藤素能明顯地抑制MDA-MB-231細(xì)胞磷酸化Akt和survivin蛋白的表達(dá)，增加cleaved caspase-3蛋白水平。3Gy的Y射線能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞磷酸化Akt、cleaved caspase-3蛋白水平上調(diào)，對(duì)survivin蛋白的表達(dá)無影響。而聯(lián)合使用能進(jìn)一步抑制MDA-M

10、B-231細(xì)胞磷酸化Akt和survivin蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)， cleaved easpase-3蛋白表達(dá)水平增加(P<0.001)。10nmol/L魚藤素與3Gy的Y射線聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，細(xì)胞凋亡百分率明顯增加(P<0.01)。10nmol/L魚藤素能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)Y射線處理的敏感性，降低克隆源性細(xì)胞的生存。 【結(jié)論】魚藤素能減弱放射線對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞促生存信號(hào)通路

11、Akt磷酸化的誘導(dǎo)激活，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性。其作用機(jī)理主要是通過抑制細(xì)胞磷酸化Akt和survivin的表達(dá)，增加caspase依賴的細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期。 第三部分魚藤素同時(shí)阻斷Akt信號(hào)通路和抑制survivin的表達(dá)對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤模型放射治療增敏的研究 【目的】研究魚藤素對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤模型的治療作用，以及與放射治療聯(lián)合使用的放射增敏效果，為今后臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【材

12、料和方法】動(dòng)物：BALB/c雌性裸鼠，4-5周齡，體重18±2g/只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，共30只。接種MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞成瘤后20天左右，腫瘤體積為100-140mm3時(shí)24只平均分成4組：對(duì)照組(C組)、deguelin組(D組)、放射治療組(RT組)、deguelin+放射治療組(D+RT組)。處理的方法及劑量：C組玉米油溶劑80μl/只/次，每日1次灌胃，每周5次；D組deguelin4mg/kg(

13、80μl)每日1次灌胃，每周5次：RT組用20y60Co照射，每日1次，每周5次；D+RT組給予deguelin和2Gy 60Co處理，劑量和方法同上.連續(xù)處理6周，每周稱量裸鼠體重并用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小。使用以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積(mm3)=長(mm)×寬2(mm2)×π/6。處理結(jié)束后的第二周處死裸鼠，切取腫瘤，記錄裸鼠體重、腫瘤體積和重量，計(jì)算抑瘤率；同時(shí)切取部分腫瘤組織作流式細(xì)胞和westernblot檢查。

14、 【結(jié)果】各組裸鼠體重和移植生長腫瘤的體積在處理前具有均衡可比性。連續(xù)處理6周，腫瘤生長體積曲線顯示C組腫瘤生長最快，RT組次之，D組腫瘤生長較慢，而D+RT組腫瘤生長有縮小的趨勢(shì)。處理結(jié)束后腫瘤的平均體積(mm3)為：C組728.8±182.7，RT組427.8±106.4，D組260.8±68.4，D+RT組95.5 ±18.7。平均腫瘤重量(g)為：C組1.28±0.21，RT組0.68±0.14，D組0.42±0.06，D+R

15、T組0.25±0.05。平均抑瘤率為：RT組46.88％±10.95％，D組67.19％±5.01％，D+RT組80.60％±3.68％。各處理組之間及處理組與對(duì)照組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000)。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明與對(duì)照組相比，RT組對(duì)細(xì)胞周期的影響和D組相似，都可使Gl期和GJM期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞凋亡率增加。但RT組作用無D組強(qiáng)。D+RT組的影響最大。各處理組與對(duì)照組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、意義(P<0.01)。 Western blot 檢測(cè)果表明，RT組的p-Akt、survivin的表達(dá)水平均增加，與其它組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。p-Akt和survivin的表達(dá)水平在D組衣D+RT組均是降低的，D+RT組下降更為明顯(P<0.004)。cleaved caspase-3的表達(dá)在各組均是增加的，以D+RT組增加最為明顯(P<0.001)。 【結(jié)論】放射治療能上調(diào)乳腺癌組織p-Akt和su