京海黃雞ZP2基因啟動子區(qū)甲基化對基因表達(dá)及產(chǎn)蛋數(shù)的影響分析.pdf

1、京海黃雞擁有小型、優(yōu)質(zhì)、早熟、抗逆性強(qiáng)四大特點(diǎn)。從生產(chǎn)記錄中發(fā)現(xiàn)其群體中存在300日齡產(chǎn)蛋數(shù)高和低的特殊個(gè)體。產(chǎn)蛋數(shù)作為數(shù)量性狀，其不僅易受環(huán)境的影響，同時(shí)受到微效多基因的控制。本文著眼于這兩點(diǎn)，選擇了可能對京海黃雞產(chǎn)蛋數(shù)具有影響的4個(gè)基因（ZP2基因、Stat5b基因、AMH基因、MDH1基因），采用qRT-PCR的方法研究了四個(gè)基因在300日齡京海黃雞個(gè)體組織里的表達(dá)規(guī)律，重點(diǎn)剖析了卵巢組織里的表達(dá)狀況，并通過雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)

2、對ZP2基因核心啟動子區(qū)域進(jìn)行了研究，本文還采用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)測序的方法，對卵巢組織中ZP2基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化進(jìn)行了定量檢測，同時(shí)分析了重要甲基化位點(diǎn)對基因mRNA表達(dá)量的調(diào)控作用，結(jié)合啟動子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測，分析甲基化位點(diǎn)所在區(qū)域，進(jìn)一步探討ZP2基因的分子調(diào)控機(jī)制。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測4個(gè)基因在300日齡京海黃雞9個(gè)組織中的mRNA

3、的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，ZP2基因在卵巢中的表達(dá)豐度最高，其次是腎臟;Stat5b基因在腿肌中的表達(dá)豐度最高，其次是胸肌，在卵巢中的表達(dá)量較低;AMH基因在卵巢中的表達(dá)豐度最高，其它組織中的表達(dá)量較低;MDH1基因在心臟中的表達(dá)豐度最高，其次是腿肌，在卵巢中表達(dá)量較低。ZP2基因在高產(chǎn)組中的表達(dá)量極顯著高于低產(chǎn)組(P＜0.01)，Stat5b基因和AMH基因在高產(chǎn)組的表達(dá)量低于低產(chǎn)組，但沒有明顯差異，MDH1基因在兩組間的表達(dá)量幾乎相同。以上結(jié)果

4、說明，ZP2基因表達(dá)上調(diào)對京海黃雞的產(chǎn)蛋數(shù)有一定影響，Stat5b基因和MDH1基因?qū)┖｜S雞的產(chǎn)蛋數(shù)可能沒有直接影響，AMH基因在卵巢中具有較高的表達(dá)量，但高低產(chǎn)組的表達(dá)差異不顯著，其在京海黃雞卵巢中發(fā)揮的作用還需進(jìn)一步研究。
　　2.京海黃雞ZP2基因啟動子系列缺失片段在DF-1細(xì)胞中具有不同的啟動子活性，重組質(zhì)粒pGL3-P6的活性最高，pGL3-P5的活性明顯下降，說明ZP2基因啟動子的核心區(qū)域在-1552～-1348之間

5、，與Neural Network PromoterPredietion在線網(wǎng)站預(yù)測的結(jié)果一致。
　　3.通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)ZP2基因啟動子區(qū)共有4個(gè)CpG島，利用BSP技術(shù)檢測啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)。ZP2-1擴(kuò)增片段總體甲基化程度與mRNA表達(dá)量有一定程度的負(fù)相關(guān)(R=-0.197，P=0.672)，所有單個(gè)位點(diǎn)的甲基化程度與mRNA表達(dá)量的相關(guān)性都沒有達(dá)到顯著水平;ZP2-2擴(kuò)增片段總體的甲基化程度與mRNA的表達(dá)量也有一