THP-1分化巨噬細胞的鈹攝入及相關(guān)生物學影響研究.pdf

1、金屬鈹(Beryllium)是最輕的穩(wěn)定金屬，具有眾多優(yōu)異的物理化學性質(zhì)，在航空、核能、國防和電子等高科技領(lǐng)域得到應用廣泛。然而鈹也是自然界毒性最強的金屬元素之一，即使是吸入微量的含鈹?shù)姆蹓m也可能會誘發(fā)慢性鈹疾病(chronic beryllium disease，CBD)。CBD是由細胞介導的遲發(fā)型變態(tài)性疾病，是一種鈹特異的CD4+T細胞在疾病部位累積而維持的以肺部肉芽腫表現(xiàn)為主的全身性疾病，其結(jié)果可能是致命的。盡管鈹?shù)纳锘瘜W及CB

2、D的研究已取得一定進展，但仍有很多關(guān)鍵性問題有待解答。例如：肺泡巨噬細胞攝入鈹?shù)闹饕緩绞鞘裁矗旊x子和哪些蛋白組成鈹抗原，鈹化合物是如何干擾免疫系統(tǒng)正常生理功能等。 基于人髓單核細胞株THP-1在佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)等化學物質(zhì)的刺激下可分化為巨噬細胞，其許多細胞化學和免疫學特征，如溶菌酶的產(chǎn)生、吞噬活性、對T細胞的免疫反應等，都和人源的肺泡巨噬細胞非常相近，我們選擇THP-1分化

3、巨噬細胞來模擬肺泡巨噬細胞，研究鈹?shù)募毎麛z入途徑及其生物學效應。首先，我們運用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)建立了檢測細胞鈹含量的分析方法，考察了不同鈹化合物刺激培養(yǎng)時鈹?shù)募毎麛z入情況。同時應用流式細胞術(shù)、熒光顯微鏡、免疫印跡等實驗技術(shù)，研究巨噬細胞攝入鈹之后是否引起細胞凋亡以及腫瘤壞死因子TNF-α表達的上調(diào)。全文包含以下幾個部分： 第一章：介紹鈹?shù)奈锢砘瘜W性質(zhì)、用途以及CBD免疫病理機制假說，闡述CBD病理機制研究的重

4、要性，并對相關(guān)研究進展進行較為詳細的綜述，提出建立體外模型研究細胞的鈹攝入機制及其相關(guān)生物學影響的實驗構(gòu)想。 第二章：優(yōu)化人髓單核細胞株THP-1分化為巨噬細胞的條件，考察PMA濃度、刺激時間對于細胞分化的影響。從分化后巨噬細胞的形態(tài)、巨噬細胞表面CD14表達量的變化(流式細胞術(shù)分析)以及巨噬細胞吞噬熒光微球的能力等幾個方面確認THP-1的良好分化。實驗結(jié)果表明，THP-1細胞在100 ng/mL PMA的誘導下48小時可分化成

5、性能良好的巨噬細胞。 第三章：建立快速、靈敏的ICP-MS檢測細胞鈹含量的分析方法，考察THP-1分化巨噬細胞與不同濃度的BeO、BeSO4孵育培養(yǎng)，細胞內(nèi)鈹?shù)臄z入量隨時間的變化情況，并通過所得數(shù)據(jù)分析鈹化合物的主要攝入途徑。實驗結(jié)果表明，100μM的BeO和BeSO4刺激培養(yǎng)48小時之后，細胞的鈹含量分別為78.2±7.6nmol/106 cells and7.2±0.5 nmol/106，BeO的攝入量要遠遠大于BeSO4，

6、這說明巨噬細胞對鈹?shù)臄z入以吞噬作用為主。此外，我們也考察了轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)及細胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的傳輸途徑對鈹離子的攝入影響。實驗結(jié)果顯示，transferrin在鈹離子的攝入過程中也起到了一定的重要作用。我們推測，transferrin等一些和鈹有較強親和力生物大分子以及這些生物分子在細胞表面的受體組成的傳輸途徑均有可能協(xié)助可溶性鈹化合物進入細胞。 第四章：考察BeO、BeSO4的刺激培養(yǎng)，THP-1分化巨噬

7、細胞攝入鈹之后的凋亡效應和細胞因子TNF-α分泌情況的變化。DAPI染色以及Western blotting的檢測結(jié)果表明無論是BeSO4還是BeO，THP-1分化巨噬細胞均沒有因為攝入大量鈹化合物而產(chǎn)生異常的凋亡情況，這也部分解釋了CBD為何是慢性的。同時，我們也檢測了腫瘤壞死因子TNF-α的分泌情況。加入鈹化合物48小時后，TNF-α分泌并沒有出現(xiàn)明顯上調(diào)。這些實驗結(jié)果表明，巨噬細胞本身對于呼吸道攝入的鈹是比較耐受的，肺泡巨噬細胞并