銀杏內(nèi)酯B改善實驗性脊髓損傷大鼠運(yùn)動能力和抑制脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)由于神經(jīng)元死亡及其纖維的中斷導(dǎo)致神經(jīng)沖動傳導(dǎo)障礙，從而引起的截癱，其治療作為醫(yī)學(xué)難題一直倍受關(guān)注。近年來，隨著現(xiàn)代交通、建筑業(yè)的發(fā)展，其發(fā)病率一直居高不下，并且至今尚無特異有效的治療方法，因此如何有效的救治脊髓損傷患者，保護(hù)脊髓損傷后的神經(jīng)元，減少其死亡，促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)，具有極其重要的醫(yī)療價值和社會意義。 脊髓損傷的最終結(jié)果是由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷共同作用所決定

2、。脊髓的原發(fā)性損傷迅速使細(xì)胞膜瓦解，破壞髓鞘、軸突及微管系統(tǒng)，從而釋放許多有害物質(zhì)引發(fā)更為嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是由多種細(xì)胞和分子機(jī)制啟動的病理生理過程所導(dǎo)致的神經(jīng)退行性變。這種神經(jīng)退行性變不僅局限在損傷部位，還擴(kuò)散到損傷周邊部位。由于原發(fā)性損傷的不可逆轉(zhuǎn)性，故目前臨床治療主要是針對脊髓創(chuàng)傷后一系列繼發(fā)性損傷的細(xì)胞分子機(jī)制，如：自由基生成、一氧化氮、血小板活化因子、興奮性氨基酸、細(xì)胞內(nèi)外離子紊亂、血管內(nèi)皮生長因子/滲透性因子、脂質(zhì)

3、過氧化及細(xì)胞凋亡等。近年研究認(rèn)為多種因子所誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡在脊髓繼發(fā)性損傷中占有重要地位，是影響神經(jīng)功能恢復(fù)的重要因素。因此盡早采取有效措施，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)損傷脊髓，挽救瀕死的神經(jīng)細(xì)胞，增加細(xì)胞的存活量，促進(jìn)軸突的修復(fù)和再連接，可以顯著改善受損脊髓的神經(jīng)功能。 銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B，GB)是一種銀杏葉提取物，有很強(qiáng)的拮抗血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)作用，還可通過對抗

4、谷氨酸興奮性毒作用來保護(hù)神經(jīng)元，并且有效的治療多發(fā)性硬化癥及阿耳茨海默(氏)病 (Alaheimer's Disease，AD)?，F(xiàn)代研究證實其具有多重藥理學(xué)作用，可作為自由基清除劑和血小板活化因子拮抗劑有效地防止自由基的脂質(zhì)過氧化對人體帶來的危害，改善血小板凝集，防止血管內(nèi)皮損傷，抑制微血栓形成，以及調(diào)節(jié)脂類代謝紊亂等。研究還發(fā)現(xiàn)GB抑制大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮，并能減輕脊髓損傷后的逆行性損傷，而對上行運(yùn)動神經(jīng)元發(fā)揮

5、保護(hù)作用，從而促進(jìn)肢體功能的恢復(fù)。GB可以通過血腦屏障，價格低廉，具有較大的實用價值，故本實驗探討了銀杏內(nèi)酯B對大鼠急性實驗性SCI后繼發(fā)性脊髓損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并分析其可能機(jī)制。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡所發(fā)生的一系列有序的級聯(lián)反應(yīng)，關(guān)鍵是激活了一組casDase的蛋白酶。其中caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，也是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，有“死亡蛋白酶”之稱?？梢哉fcaspase-3是哺乳動物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵

6、酶，并且caspase-3介導(dǎo)的凋亡在人體多種細(xì)胞中普遍存在。利用caspase-3表達(dá)的變化作為一種病理指標(biāo)，觀察GB對SCI后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用并研究其機(jī)制，對研發(fā)SCI的防治措施具有重要意義。 本實驗應(yīng)用大鼠急性脊髓損傷實驗動物模型、CBS評分法、HE染色及NSE，caspase-3，caspase-3 p20免疫組化及流式細(xì)胞技術(shù)與方法，研究大鼠脊髓損傷后應(yīng)用6B治療后大鼠運(yùn)動行為、病理過程、神經(jīng)元的改變，及其對細(xì)胞凋亡

7、和casDase-3蛋白表達(dá)的影響，初步探討了GB對減輕大鼠急性實驗性SCI繼發(fā)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。 主要研究內(nèi)容： 1．GB對大鼠SCI組織病理學(xué)變化的影響為觀察應(yīng)用GB后SCI大鼠脊髓組織的病理學(xué)改變，本實驗對正常脊髓、SCI后不同時間點(diǎn)和GB治療后的大鼠應(yīng)用HE對脊髓組織石蠟切片進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，對照組脊髓組織灰、白質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰。損傷組在SCI后l天可見損傷區(qū)中央灰質(zhì)大片出血、

8、細(xì)胞腫脹，并有單核或多核炎細(xì)胞浸潤，胞質(zhì)呈現(xiàn)伊紅色顆粒狀，細(xì)胞邊界模糊不清。SCI后3天時損傷區(qū)開始出現(xiàn)壞死灶，可見大量嗜伊紅色素顆粒，炎性反應(yīng)加劇。7天和14天時大體觀察脊髓，損傷段變細(xì)；損傷區(qū)出現(xiàn)囊腔樣變，有些損傷脊髓組織空腔形成，周圍有炎性細(xì)胞浸潤。GB治療組脊髓組織結(jié)構(gòu)較清晰，出血、壞死程度較輕，形成囊腔少，神經(jīng)細(xì)胞腫脹不明顯。提示應(yīng)用GB后可以明顯改善SCI大鼠損傷脊髓組織的出血，水腫及炎性細(xì)胞浸潤等病理過程。 2

9、．GB對大鼠SCI后神經(jīng)元的影響SCI后神經(jīng)元數(shù)量和功能的改變是決定脊髓功能的最重要因素。本實驗應(yīng)～JNSE免疫組化的方法，觀察大鼠脊髓損傷后各組神經(jīng)元的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組神經(jīng)元輪廓清楚，在脊髓灰質(zhì)中分布均勻；SCI后神經(jīng)元在脊髓灰質(zhì)中呈散在不均勻分布，治療組與損傷組SCI后各時間點(diǎn)在損傷區(qū)NSE著色淺，神經(jīng)元幾乎消失，而正常區(qū)NSE平均陽性細(xì)胞數(shù)與對照組無明顯變化；在損傷周圍區(qū)NSE陽性細(xì)胞數(shù)變化最明顯。損傷組SCI后1天、3天、7

10、天、14天各時間點(diǎn)脊髓損傷周圍區(qū)組織的NSE平均陽性細(xì)胞數(shù)分別為12.40±1.44、7.90±1.15、7.65±1.04和8.33±1.67；GB治療后大鼠SCI后上述各時間點(diǎn)的脊髓損傷周圍區(qū)組織NSE平均陽性細(xì)胞數(shù)分別為13.32±1.64、10.43±1.89、10.72±2.24和15.05±1.69，較損傷組有非常顯著性差異，以SCI第3天時作用最明顯。提示應(yīng)用GB治療后在SC13天時便表現(xiàn)出對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并隨著應(yīng)用

11、GB時間的延長，其作用更加明顯。 3．GB對大鼠SCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響為進(jìn)一步探討SCI后傷段脊髓組織細(xì)胞死亡的性質(zhì)和GB在其中的作用，本實驗利用流式細(xì)胞單染及雙染技術(shù)，研究了各實驗組損傷脊髓組織細(xì)胞凋亡的改變。結(jié)果顯示，對照組平均神經(jīng)細(xì)胞凋亡率為1.03±0.16；損傷組SCI后1天神經(jīng)細(xì)胞凋亡率開始升高，為1.73±0.18，3天達(dá)高峰為13.38±3.29，14天仍高于正常為5.11±1.84，與對照組相比仍有顯著性升高

12、；GB治療組3天、14天神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別為3.67±1.16、2.11±0.84較損傷組非常顯著性降低。提示本實驗性大鼠脊髓損傷存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡，GB能夠減少損傷脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。 4．GB對大鼠SCI后caspase-3表達(dá)的影響：為觀察大鼠SCI后細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制和GB對其的影響，本實驗應(yīng)用caspase-3免疫組化的方法，觀察caspase-3在損傷脊髓神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)脊髓損傷周圍

13、區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)變化最明顯。對照組脊髓組織中caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)很少；損傷組在脊髓損傷周圍區(qū)組織中caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)在SCI后1天迅速增高，3天達(dá)高峰，隨后逐漸下降，14天時仍有表達(dá)；治療組較損傷組陽性細(xì)胞數(shù)從3天開始有非常顯著性降低，至14天時治療組與對照組陽性細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義。提示本實驗大鼠脊髓損傷能誘導(dǎo)caspase-3蛋白迅速而強(qiáng)烈的表達(dá)，GB能降低損傷脊髓caspase-3蛋白表達(dá)量。

14、 5．GB對大鼠SCI后cleaved caspase-3表達(dá)的影響為進(jìn)一步證實實驗組SCI后caspase-3活化過程，我們利用免疫組化方法觀察了cleaved caspase-3抗體特異性標(biāo)記caspase-3活化后的p20亞基的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實驗組均可見caspase-3p20表達(dá)，仍以脊髓損傷周圍區(qū)變化最明顯。對照組脊髓組織中caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)較少；損傷組脊髓損傷周圍區(qū)組織中caspase-3 p20陽性細(xì)胞數(shù)在SC

15、I后1天后迅速增高為16.85±3.31，3天達(dá)高峰為27.324±3.47，以后逐漸下降，但14天時仍有表達(dá)為13.02±1.21；治療組3天、7天和14天caspase-3 p20陽性細(xì)胞數(shù)分別為14.30±2.67、11.55±1.91、8.92±1.53，與損傷組比較均有非常顯著性的降低，14天GB治療組與對照組陽性細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義。提示在本實驗大鼠脊髓損傷動物模型中損傷脊髓出現(xiàn)caspase-3裂解活化過程，而GB可抑制ca

16、spase-3活化。 6.應(yīng)用GB后大鼠運(yùn)動行為的改變：大鼠SCI后可利用動物外周運(yùn)動行為活動的變化作為指標(biāo)，來反映脊髓損傷與修復(fù)的程度，這對于研究SCI大鼠脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)非常重要。本實驗采用改良后Gale聯(lián)合評分法(CBS)對SCI后各實驗組大鼠運(yùn)動行為進(jìn)行評分，以觀察GB對脊髓神經(jīng)運(yùn)動功能的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠SCI后CBS總分及其各項評分，即開放空間運(yùn)動能力、腳趾伸展、觸地反射、回縮反射、翻正反射、斜板試驗，損傷組與治療組

17、較對照組均有非常顯著性地降低；但經(jīng)GB治療后從第3天開始SCI大鼠運(yùn)動行為較損傷組有顯著性改善；隨著SCI時間的延長，損傷組與治療組大鼠肢體的運(yùn)動功能均有不同程度的自行恢復(fù)，但GB治療組大鼠在SCI后7天和14天其開放空間運(yùn)動能力、觸地和回縮反射均較損傷組大鼠有非常顯著性改善。說明SCI后應(yīng)用GB可以促進(jìn)SCI大鼠肢體遠(yuǎn)端肌肉活動和肢體協(xié)調(diào)運(yùn)動功能的恢復(fù)。 結(jié)論： (1)大鼠實驗性脊髓損傷后存在著繼發(fā)性的神經(jīng)