E2F1通過下調(diào)VEGF和PLGF的基因表達抑制心臟新生血管形成.pdf

1、目的：新生血管的不足限制了心肌組織再生，導(dǎo)致缺血性心臟疾病的發(fā)生。研究轉(zhuǎn)錄因子E2F1 對心肌缺血后新生血管形成的影響，尋求針對缺血性疾病基因治療的新靶點。
　　 方法：野生型（WT）小鼠和E2F1基因敲除（E2F1-/-）小鼠結(jié)扎心臟冠狀動脈左前降支，建立心肌梗死（MI）模型。超聲心電圖檢測兩種小鼠MI 術(shù)前3天及術(shù)后第7天、14天、28天小鼠心功能變化，免疫熒光染色檢測MI后第7天心肌梗死周圍區(qū)血管密度、內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡

2、情況。Microarray 篩選出心臟成纖維細胞缺氧時所有被E2F1 調(diào)節(jié)的基因，qRT-PCR和Western blotting 針對某些特異性基因（血管內(nèi)皮生長因子VEGF和胎盤生長因子PLGF）在缺氧的心臟成纖維細胞和缺血的心肌中mRNA和蛋白表達水平進行驗證檢測。為研究E2F1-/-小鼠較WT 小鼠MI后心功能更好的機制，WT 小鼠和E2F1-/-小鼠建立MI模型，術(shù)后腹腔注射選擇性的血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）酪

3、氨酸激酶抑制劑SU5416或VEGFR-2 阻斷性抗體DC101，超聲心電圖檢測MI 術(shù)前3天及術(shù)后第7天、14天、28天小鼠心功能變化，免疫熒光染色檢測MI 術(shù)后第7天心肌梗死周圍區(qū)血管密度、內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡情況。為研究E2F1 對VEGF和PLGF的分子調(diào)節(jié)機制，應(yīng)用化學試劑轉(zhuǎn)染E2F1 質(zhì)粒與熒光素酶標記的VEGF 啟動子或PLGF 啟動子至WT和p53-/-小鼠心臟成纖維細胞中培養(yǎng)16小時，缺氧24 小時后，根據(jù)熒光素酶活性

4、檢測VEGF和PLGF 啟動子活性；應(yīng)用核瞬間轉(zhuǎn)染裝置轉(zhuǎn)染E2F1 質(zhì)粒至WT和p53-/-小鼠心臟成纖維細胞中培養(yǎng)8 小時，缺氧24 小時后，qRT-PCR檢測VEGF和PLGF mRNA水平。WT 小鼠心臟成纖維細胞缺氧16 小時后，ChIP assay 檢測p53是否結(jié)合在VEGF的啟動子上。為研究缺氧時E2F1與p53分子之間的相互作用，co-IP 檢測內(nèi)源性的E2F1和p53是否相互作用；WT和E2F1-/-心臟成纖維細胞缺氧

5、后加入環(huán)己酰胺（CHX）或者CHX與MG132，Western blotting 檢測兩種細胞中p53 蛋白降解情況。為研究調(diào)節(jié)VEGF的E2F1分子功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，構(gòu)建不同長度的E2F1 突變體質(zhì)粒，co-IP 檢測E2F1:p53 相互作用區(qū)域，根據(jù)熒光素酶活性檢測E2F1 調(diào)節(jié)VEGF 啟動子的功能區(qū)域。
　　 結(jié)果：體內(nèi)實驗中，與WT 小鼠相比，E2F1-/-小鼠MI 術(shù)后心功能更好，心肌梗死面積更小，心肌梗死周圍區(qū)血管密

6、度更高、增殖和存活的內(nèi)皮細胞更多。E2F1-/-小鼠缺血的心肌中血管生長因子VEGF和PLGF表達增高、p53表達降低。WT 小鼠和E2F1-/-小鼠MI 術(shù)后體內(nèi)后給予選擇性的VEGFR-2 酪氨酸激酶抑制劑SU5416或VEGFR-2 阻斷性抗體DC101，兩者心肌梗死周圍區(qū)血管密度都明顯減少、心功能間的差異明顯消失。體外實驗中，與WT 心臟成纖維細胞相比，缺氧誘導(dǎo)E2F1-/-心臟成纖維細胞表達更多的VEGF和PLGF。WT 心臟