亞洲帶絳蟲和鏈狀帶絳蟲幼蟲入侵中間宿主及其致局灶性肝纖維化的研究.pdf

1、目的:
　　亞洲帶絳蟲（Taenia asiatica）和鏈狀帶絳蟲（Taenia solium）都以家豬為適宜中間宿主并可在豬的肝臟寄生，為何前者僅局限于肝臟，而后者還更廣泛地寄生于豬全身肌肉及腦等組織器官并可導(dǎo)致人囊尾蚴?。繛樘接戇@個問題，本文擬從以下4個方面進(jìn)行研究:①了解云南大理地區(qū)兩種絳蟲流行情況并進(jìn)行蟲種分子鑒定和幼蟲形態(tài)學(xué)研究;②研究兩種帶絳蟲六鉤蚴和囊尾蚴在豬體的入侵、移行路徑、分布和定植的異同;③研究兩者致中間宿

2、主肝損傷及局灶性肝纖維化的分子病理機(jī)制;④觀察兩者致靈長類動物囊蟲病及肝損害的可能性。
　　方法:
　　1、蟲體采集及鑒別
　　在云南大理對帶絳蟲癥患者以口服生南瓜籽、檳榔煎劑驅(qū)蟲，生理鹽水反復(fù)清洗，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。
　?、傩螒B(tài)學(xué)鑒別
　　觀察成蟲頭節(jié)、孕節(jié)形態(tài)特征，收集蟲卵，經(jīng)酶法孵育后，取純化的六鉤蚴接種至免疫抑制的小鼠皮下，55～60天后檢獲囊尾蚴;以形態(tài)特征不典型的疑似鏈狀帶絳蟲蟲卵感染獼猴，觀察囊尾

3、蚴在獼猴體內(nèi)的分布;以普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡分別觀察囊尾蚴的形態(tài)。
　?、诜肿由飳W(xué)鑒別
　　提取蟲體DNA，并取已知亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲作對照，分別以亞洲帶絳蟲、鏈狀帶絳蟲和牛帶絳蟲特異性引物和通用引物進(jìn)行cox1片段或全基因的PCR擴(kuò)增，從3種帶絳蟲PCR陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物中各選擇1份進(jìn)行核酸序列測定，序列登錄至GenBank，并用NCBI Blast將各核酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中帶絳蟲的cox1進(jìn)行比對分析。

4、>　　2、兩種帶絳蟲六鉤蚴對感染初期實(shí)驗(yàn)家豬腸黏膜屏障的破壞及其在宿主體內(nèi)移行和分布的觀察
　?、儆^察兩種六鉤蚴對豬腸黏膜屏障功能的影響
　　實(shí)驗(yàn)組和對照組乳豬于感染前抽血進(jìn)行外周血細(xì)菌培養(yǎng)和分離血清備用。分別以鏈狀帶絳蟲和亞洲帶絳蟲蟲卵經(jīng)消化道感染實(shí)驗(yàn)組乳豬，感染第4天，無菌操作抽血分別進(jìn)行外周血細(xì)菌培養(yǎng)和分離血清備用;采用比色法定量檢測血清D-乳酸，顯色基質(zhì)鱟試劑法定量檢測血清內(nèi)毒素;取部分小腸組織經(jīng)固定后分別進(jìn)行常規(guī)石

5、蠟包埋切片HE染色和超薄切片制備，分別以光鏡和透射電鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察。
　?、谟^察兩種六鉤蚴經(jīng)消化道感染家豬后在小腸及相鄰組織器官的分布，探討其移行路徑
　　于感染第4天取家豬小腸、腸系膜、腸系膜上淋巴結(jié)和肝臟進(jìn)行消化、過濾、離心和分離，分別通過顯微鏡下仔細(xì)尋找和觀察六鉤蚴的存在，并且采用PCR技術(shù)檢查兩種絳蟲DNA的cox1片段在各組織的存在。
　?、鄱o脈注射感染亞洲帶絳蟲六鉤蚴后蟲體在幼豬體內(nèi)分布和致病的觀察

6、r>　　以耳靜脈注射的方式使幼豬感染亞洲帶絳蟲六鉤蚴，第35天剖檢，取病變組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，觀察六鉤蚴在幼豬體內(nèi)各組織器官定植、發(fā)育和引起病變的情況，并采用PCR擴(kuò)增組織中亞洲帶絳蟲cox1片段。
　　3、帶絳蟲囊尾蚴致家豬局灶性肝纖維化的病理和分子病理觀察
　　分別以亞洲帶絳蟲和鏈狀帶絳蟲蟲卵經(jīng)消化道感染家豬，于感染第70天剖檢，以放射免疫法進(jìn)行血清透明質(zhì)酸的檢測、ELISA法進(jìn)行肝細(xì)胞生長因子的檢測;取肝組織固定后

7、分別經(jīng)HE染色和改良Masson染色觀察病理特征，以免疫組化法檢測肝組織α-平滑肌肌動蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)。
　　4、囊尾蚴致局灶性肝纖維化小動物模型的建立
　　以兩種帶絳蟲的六鉤蚴經(jīng)尾靜脈注射感染小鼠構(gòu)建囊尾蚴致肝纖維化小動物模型，感染第55～60天取肝組織以10％中性甲醛固定后分別經(jīng)HE染色和改良Masson染色觀察病理特征，以免疫組化法檢測肝組織α-平滑肌肌動蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)。
　　5、兩

8、種帶絳蟲蟲卵感染獼猴的實(shí)驗(yàn)研究
　　以兩種帶絳蟲的蟲卵分別經(jīng)消化道感染獼猴。鏈狀帶絳蟲感染的獼猴于感染第84天，亞洲帶絳蟲感染的獼猴于感染第44天抽血分離血清，以全自動生化分析儀進(jìn)行肝功能檢測、固相放射免疫法進(jìn)行血清透明質(zhì)酸檢測，ELISA法檢測囊尾蚴IgG，并對獼猴進(jìn)行肝臟彩超檢查;鏈狀帶絳蟲感染的獼猴于感染第90天，亞洲帶絳蟲感染的獼猴于感染第50天剖檢，仔細(xì)檢查肝臟病變，取肝組織以10％中性甲醛固定后進(jìn)行HE染色，鏡下觀察病

9、變特征。
　　結(jié)果:
　　1、蟲種的鑒別
　?、傩螒B(tài)學(xué)鑒別
　　在云南大理共采集到29條帶絳蟲，其中25條孕節(jié)子宮分支數(shù)大于15，初步鑒別為亞洲帶絳蟲;4條孕節(jié)子宮分支數(shù)為7～12，其中一條頭節(jié)受損，形態(tài)特征不清楚，另三條有頂突但小鉤數(shù)目異常，分別為0、4和10，初步鑒定為鏈狀帶絳蟲。亞洲帶絳蟲的囊尾蚴有頂突但無小鉤，掃描電鏡下見囊壁表面有疣狀突起，頭節(jié)頂部有吻狀頂突，頂突處無小鉤，但卻分布大量的菜花樣突起，吸盤

10、成發(fā)髻樣。小鉤數(shù)目異常的鏈狀帶絳蟲的幼蟲感染獼猴后，幼蟲可寄生于獼猴的肌肉和肝臟，肌肉中的囊尾蚴呈現(xiàn)典型的豬囊尾蚴特征，有頂突及內(nèi)外兩圈共28個小鉤，電鏡下見吸盤呈火山口狀，囊壁表面雖無疣狀突起，但卻有許多溝回和皺折。
　?、诜肿由飳W(xué)鑒別:從25條無頂突的帶絳蟲經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增得到亞洲帶絳蟲cox1片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與GenBank中多株亞洲帶絳蟲cox1的同源性為100％，因此鑒定為亞洲帶絳蟲;頭節(jié)受損形態(tài)不清和3條頭

11、節(jié)小鉤數(shù)目異常的帶絳蟲經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增得到鏈狀帶絳蟲cox1片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與GenBank中多株鏈狀帶絳蟲cox1的同源性為99.8％，鑒定為鏈狀帶絳蟲。
　　2、兩種帶絳蟲六鉤蚴對感染初期實(shí)驗(yàn)家豬腸黏膜屏障的破壞及其在宿主體內(nèi)的移行和分布
　　兩種帶絳蟲蟲卵經(jīng)消化道感染第4天的乳豬中分別有一頭的外周血細(xì)菌培養(yǎng)由感染前的陰性轉(zhuǎn)為陽性，檢出大腸埃希菌和變形桿菌;各感染乳豬血清D-乳酸和內(nèi)毒素含量均較感染前增高（t檢

12、驗(yàn)，P小于0.05）;光鏡下見腸黏膜明顯損傷，損傷級別為Ⅲ～Ⅳ級;電鏡觀察顯示小腸上皮細(xì)胞間緊密連接破壞，線粒體腫脹甚至破裂，小腸微絨毛排列紊亂或脫落。兩種帶絳蟲蟲卵感染的乳豬小腸、腸系膜和腸系膜上淋巴結(jié)可檢出六鉤蚴或/和其DNA。
　　經(jīng)耳靜脈感染家豬的亞洲帶絳蟲六鉤蚴可在肝臟發(fā)育成囊尾蚴，在肺、腎、肌肉、皮下和腦組織均未見囊尾蚴，但肝、肺、腎、肌肉和皮下組織均發(fā)現(xiàn)以嗜酸性肉芽腫為主要特征的病變，并且病變組織可擴(kuò)增出亞洲帶絳蟲c

13、ox1片段。
　　3、帶絳蟲囊尾蚴致家豬局灶性肝纖維化的病理和分子病理改變
　　感染70天后，兩種帶絳蟲幼蟲感染的家豬血清透明質(zhì)酸和肝細(xì)胞生長因子含量均較感染前增高，差異有顯著性（P小于0.05）。蟲體在宿主肝臟寄生的局部均發(fā)生相似的組織病理學(xué)改變，主要表現(xiàn)為肉芽腫和局灶性肝纖維化，可見肝細(xì)胞水腫和脂肪變性;部分肝細(xì)胞呈小灶性壞死;肝血竇擴(kuò)張、淤血。兩種帶絳蟲幼蟲感染的家豬肝組織TGF-β1和α-SMA的表達(dá)明顯高于對照組，

14、但兩組之間無明顯差異:TGF-β1在肝竇壁及竇周細(xì)胞、壞死灶及匯管區(qū)，以及纖維間隔和肝細(xì)胞中均有分布;α-SMA廣泛表達(dá)在纖維間隔、肝竇、纖維間隔周圍的肝細(xì)胞、匯管區(qū)和中央靜脈，而正常對照組僅在匯管區(qū)血管壁和中央靜脈血管壁有表達(dá)。
　　4、小鼠肝臟組織病理學(xué)改變
　　兩種帶絳蟲幼蟲感染在小鼠肝臟引起的組織病理學(xué)改變也相似，主要表現(xiàn)為多個肉芽腫，廣泛的肝纖維化以及大片的肝細(xì)胞壞死，鏈狀帶絳蟲幼蟲感染的小鼠肝臟還可見小膽管增生。

15、感染組小鼠的肝組織TGF-β1和α-SMA的表達(dá)和分布情況與感染組家豬相似，表達(dá)均較對照組明顯增強(qiáng)。
　　5、兩種帶絳蟲幼蟲感染獼猴的實(shí)驗(yàn)研究
　　鏈狀帶絳蟲幼蟲感染的獼猴體重較感染前減輕2.4kg;肝臟彩超檢查顯示肝臟內(nèi)多個結(jié)節(jié)樣回聲;血清總膽汁酸鹽為感染前的4.5倍，透明質(zhì)酸為感染前的1.9倍，膽堿酯酶較感染前降低25％;肝組織內(nèi)見11個結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)內(nèi)可見壞死的蟲體和以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，周圍纖維結(jié)締組織增生，

16、可見肝細(xì)胞脂肪變性和壞死;血清豬囊尾蚴IgG陽性。亞洲帶絳蟲幼蟲感染的獼猴體重較感染前減輕0.7kg，肝臟彩超檢查未見明顯異常;血清亞洲帶絳蟲囊尾蚴IgG陰性;肝組織內(nèi)未見蟲體和病灶。
　　結(jié)論:
　　云南大理同時存在亞洲帶絳蟲和鏈狀帶絳蟲流行;鏈狀帶絳蟲頭節(jié)存在頂突小鉤缺失的異常形態(tài)表現(xiàn)，可能是當(dāng)?shù)嘏R床和流行病學(xué)調(diào)查中鏈狀帶絳蟲少見的原因之一;利用帶絳蟲種特異性引物進(jìn)行cox1片段的PCR擴(kuò)增或通用引物進(jìn)行cox1基因的P

17、CR擴(kuò)增和核酸序列測定可進(jìn)行人體帶絳蟲的分子鑒別。兩種帶絳蟲六鉤蚴入侵和突破豬腸黏膜屏障的表現(xiàn)相似，并均可經(jīng)小腸進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)，但亞洲帶絳蟲幼蟲僅能適應(yīng)肝臟的內(nèi)環(huán)境并在肝組織生長和發(fā)育，而與其他組織器官不相容。兩種帶絳蟲囊尾蚴在豬肝臟引起相似的病理變化，肝臟的慢性損害刺激TGF-β1的大量表達(dá)，激活HSC，活化的HSC又分泌TGF-β1，促進(jìn)HSC合成細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致局灶性肝纖維化。鏈狀帶絳蟲蟲卵能夠?qū)嶒?yàn)感染靈長類動物獼猴，在肌