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文檔簡介
1、1、背景:
傳統(tǒng)的分類學(xué)把人體帶絳蟲分為豬帶絳蟲(Taenia solium)和牛帶絳蟲(Taenia saginaia)兩種。近三十年來,在東南亞和西太平洋的許多國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)了另一種新的帶絳蟲,其成蟲特征幾乎和牛帶絳蟲一致,而囊尾蚴又與豬帶絳蟲幼蟲相似,寄生在中間宿主豬的體內(nèi),人因生食豬肝等內(nèi)臟而感染,這種帶絳蟲被命名為亞洲帶絳蟲(Taenia asiatica)。人是以上三種帶絳蟲唯一的終宿主,豬和牛是其主要的中間宿主,
2、豬帶絳蟲蟲卵感染還可引起嚴(yán)重的囊尾蚴病(囊蟲?。?。我國北部和西部地區(qū)是帶絳蟲病和囊蟲病較嚴(yán)重的流行區(qū)。研究證實在貴州的都勻地區(qū)存在亞洲帶絳蟲的流行,從江地區(qū)存在牛帶絳蟲的流行,患者主要是青壯年,對當(dāng)?shù)氐膭趧由a(chǎn)力影響很大,是危害西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)經(jīng)濟社會發(fā)展的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。
近幾年來我們在亞洲帶絳蟲的分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、組織病理學(xué)和免疫學(xué)、基因組學(xué)等研究領(lǐng)域做了大量的研究,研究證實亞洲帶絳蟲的分類學(xué)地位是介于豬帶絳蟲和
3、牛帶絳蟲之間的一個獨立種,從分子進(jìn)化的角度分析,其基因序列和蛋白質(zhì)序列與豬帶和牛帶都有很高的同源性。因此可以推斷,亞洲帶絳蟲的某些抗原,可作為豬帶絳蟲和牛帶絳蟲的通用抗原,可作為豬帶絳蟲和牛帶絳蟲免疫診斷和疫苗的候選抗原,利用課題組在亞洲帶絳蟲的地域優(yōu)勢和基因資源優(yōu)勢,發(fā)展我國的帶絳蟲診斷試劑盒和疫苗開發(fā)是本研究的主要目標(biāo),針對中間宿主(豬、牛)和終宿主(人)的抗感染疫苗是預(yù)防這些寄生蟲病的重要策略??莶菅挎邨U菌(Bacillus su
4、btilis)作為一種新型口服疫苗載體系統(tǒng),具有傳統(tǒng)口服疫苗載體不可比擬的優(yōu)勢:①枯草芽孢桿菌具有良好的安全性,已作為益生菌廣泛應(yīng)用于人及動物;②枯草芽孢桿菌耐性強,對干燥、高溫、高壓、氧化、及酸、堿毒物等等不良環(huán)境的抵抗力強,可在室溫條件下長期儲存;③枯草桿菌基因組的研究已較完善,枯草桿菌克隆技術(shù)也比較成熟;④以芽孢狀態(tài)口服,枯草芽孢桿菌在排出體外之前,其在小腸有可能經(jīng)過發(fā)芽、復(fù)制過程。研究表明,大部分枯草芽孢通過胃腸道后仍能存活???/p>
5、草芽孢衣殼蛋白融合表達(dá)的抗原具有很高的穩(wěn)定性,能抵抗胃酸和腸道消化酶的破壞,維持蛋白穩(wěn)定的構(gòu)象,腸道益生菌枯草芽孢能很好保護表達(dá)在其表面的抗原,并具有強大的佐劑功能。
根據(jù)已知的豬、牛帶絳蟲六鉤蚴18kD基因的序列,我們從亞洲帶絳蟲六鉤蚴中克隆并鑒定了Ta18基因。生物信息學(xué)分析表明,該基因與牛帶絳蟲18kDa蛋白一致性達(dá)99%,與豬帶絳蟲一致性達(dá)97%,所以推斷該基因為亞洲帶絳蟲18kDa基因,命名為Ta18基因。18kD基
6、因被公認(rèn)為是帶絳蟲科最具有前途的疫苗候選基因,同時,豬帶絳蟲TsOL18和TSOL-45及細(xì)粒棘球絳蟲Eg95的重組抗原免疫保護性效果已被充分證實,這類蛋白的生物學(xué)功能未知,同源性也不高,但都有含有一個纖連蛋白III的功能域,推測該類蛋白的免疫保護性取決于構(gòu)象表位而非線性表位,重組蛋白因不容易保持穩(wěn)定的構(gòu)象而限制其推廣應(yīng)用,我們利用生物信息學(xué)對 Ta18基因一級結(jié)構(gòu)的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其具有FnIII功能域。
本研究在對
7、 Ta18基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上,從枯草桿菌基因組中擴增芽孢衣殼蛋白CotC,將Ta18基因克隆入CotC結(jié)構(gòu)基因的下游,采用枯草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草桿菌 WB600并誘導(dǎo)芽孢生成,構(gòu)建Pus186-CotC-Ta18重組枯草芽孢工程菌。展開對 Ta18重組枯草芽孢的生物學(xué)特性研究,分析其所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答特征,對其免疫保護效果進(jìn)行評估,為搭建新型高效抗絳、囊蟲病口服疫苗平臺奠定基礎(chǔ)。
2、目的和意
8、義:
以分類地位介于豬帶絳蟲和牛帶絳蟲的亞洲帶絳蟲作為突破點,充分發(fā)揮學(xué)科交叉優(yōu)勢,使用枯草芽孢桿菌作為表達(dá)載體,對亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因進(jìn)行原核表達(dá),關(guān)于利用枯草芽孢表達(dá)帶絳蟲候選抗原基因至今未見報道,探索以芽孢型益生菌候選抗原遞送系統(tǒng)刺激抗亞洲帶絳蟲蟲卵感染的免疫特點,分析免疫應(yīng)答類型、強度、及對攻擊感染的保護效果。本項目擬從中間宿主入手,研制豬、牛用口服疫苗,切斷傳播途徑,從而達(dá)到預(yù)防絳、囊蟲病的目的。以帶絳蟲功能
9、基因組學(xué)研究為基礎(chǔ),以新型原核表達(dá)平臺為手段,以實用化應(yīng)用成果為目標(biāo),利用先進(jìn)的技術(shù)手段實現(xiàn)基礎(chǔ)研究成果的轉(zhuǎn)化。
3、方法:
3.1亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因的生物信息學(xué)分析及重組枯草芽孢工程菌的構(gòu)建
3.1.1亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因生物信息學(xué)分析
利用美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI網(wǎng)站的BLASTx對測序所得核酸序列進(jìn)行分析,用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASY)提供
10、的生物信息學(xué)工具對Ta18基因所編碼蛋白的功能和特性進(jìn)行預(yù)測。ProtParam分析預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。
3.1.2亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因的克隆、表達(dá)
鑒定亞洲帶絳蟲成蟲,孵化蟲卵,提取六鉤蚴總RNA并合成cDNA,設(shè)計引物擴增六鉤蚴Ta18基因,鑒定pET-28a(+)-Ta18重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá)Ta18重組蛋白,大量表達(dá)并純化,獲得純化蛋白,測定蛋白濃度。
3.1.3 Ta18重組蛋白抗血清制備
11、
使用純化的Ta18重組蛋白皮下注射免疫大鼠,獲得Ta18特異性抗血清。
3.1.4 Ta18的免疫原性和免疫反應(yīng)性分析
用制備的Ta18重組蛋白抗血清,Western Blotting方法檢測Ta18重組蛋白的免疫原性及免疫反應(yīng)性。
3.1.3亞洲帶絳蟲六鉤蚴 Ta18重組枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建
提取枯草桿菌基因組 DNA,設(shè)計引物擴增芽孢外殼蛋白 CotC,目的基因 CotC和Ta
12、18與質(zhì)粒 Pus186連接,轉(zhuǎn)化枯草桿菌 WB600原生質(zhì)體,構(gòu)建并鑒定Pus186-CotC-Ta18融合表達(dá)載體,誘導(dǎo)芽孢生成,收集、定量芽孢,提取芽孢外殼蛋白并檢測。Western Blotting方法檢測Ta18重組枯草芽孢的免疫反應(yīng)性。
3.2 Ta18重組枯草芽孢的生物學(xué)特性研究
3.2.1Ta18重組枯草芽孢的抗性評估
配置模擬胃液和腸液,調(diào)節(jié)好pH值。將離心后的菌液重懸于模擬胃、腸液中,鋪
13、板,計數(shù)。
3.2.2重組芽孢表面Ta18的免疫熒光、流式細(xì)胞儀檢測
以大鼠抗Ta18重組蛋白的免疫血清為一抗,熒光標(biāo)記抗大鼠IgG為二抗,檢測目的蛋白在芽孢表面的表達(dá),同時,對重組芽孢進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。
3.2.3 Ta18在亞洲帶絳蟲的組織定位及階段表達(dá)研究
以大鼠抗Ta18重組蛋白的免疫血清為一抗,以綠色熒光標(biāo)記的抗大鼠IgG為二抗,檢測 Ta18基因在亞洲帶絳蟲成蟲、蟲卵及囊尾蚴的組織定
14、位,并在熒光顯微鏡下觀察、拍照。分別以亞洲帶絳蟲成蟲頭節(jié)cDNA文庫、成蟲成節(jié)cDNA、成蟲孕節(jié)cDNA及囊尾蚴cDNA文庫為模板,用合成引物擴增,進(jìn)行階段表達(dá)分析。
3.3 Ta18重組枯草芽孢免疫保護性效果評估
3.3.1 Ta18重組枯草芽孢口服免疫家豬血清中IgG及糞便中IgA的含量變化研究
設(shè)Pus186-CotC-Ta18芽孢組、Pus186-CotC芽孢組及常規(guī)感染組,口服免疫家豬,定期收集血
15、清和糞便,ELISA法檢測血清中IgG及糞便中IgA的含量變化。
3.3.2抗Ta18多抗對亞洲帶絳蟲六鉤蚴體外作用
分離亞洲帶絳蟲蟲卵,體外孵化六鉤蚴,實驗分3組進(jìn)行體外殺傷六鉤蚴實驗,統(tǒng)計學(xué)分析。
3.3.3 Ta18重組枯草芽孢口服疫苗免疫保護性效果研究
3.3.3.1蟲卵攻擊感染實驗
分三組:重組枯草芽孢組(Pus186-CotC-Ta18)、空載體枯草芽孢組(Pus186-Co
16、tC)和常規(guī)感染組(用生理鹽水處理)口服免疫家豬后,用亞洲帶絳蟲蟲卵攻擊,于30、40天,處死家豬,仔細(xì)檢查家豬體內(nèi)囊尾蚴寄生情況,計數(shù)蟲荷。
3.3.4實驗感染家豬肝臟的病理學(xué)變化
取各感染豬肝臟組織分別置于10%甲醛內(nèi)固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片,H. E.染色,鏡檢。
4、結(jié)果:
4.1亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18的生物信息學(xué)分析及重組枯草芽孢工程菌的構(gòu)建
4.1.1 Ta18基因生物信息學(xué)
17、分析
生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示Ta18基因序列與GenBank中的牛帶絳蟲18kD蛋白的一致性達(dá)99%;與豬帶絳蟲一致性達(dá)97%,包含完整的開放閱讀框,為全長cDNA序列,序列長度為396bp,編碼131個氨基酸。預(yù)測Ta18蛋白質(zhì)的理論分子量為14810.4 Da;等電點為10.05,其他理化性質(zhì)均較穩(wěn)定。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該基因含有一信號肽序列,蛋白翻譯后結(jié)構(gòu)特征預(yù)測發(fā)現(xiàn)在30-117位氨基酸處含有一個絳蟲屬18kD基因共有的纖
18、連蛋白FnⅢ型結(jié)構(gòu)域。
4.1.2亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因的克隆、表達(dá)
成功從亞洲帶絳蟲六鉤蚴中擴增出Ta18基因,并克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)上,通過雙酶切及DNA測序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET28a(+)-Ta18構(gòu)建成功。表達(dá)重組質(zhì)粒并獲得純化蛋白。Western Blotting分析結(jié)果表明,重組Ta18純化蛋白能被重組蛋白免疫的SD大鼠血清識別,具有較好的免疫原性;同時也能被帶絳蟲病患者血清識別
19、,說明重組蛋白具有免疫反應(yīng)性。
4.1.3 Ta18重組枯草芽孢工程菌的構(gòu)建
提取枯草桿菌基因組,設(shè)計特異性引物擴增出芽孢外殼蛋白CotC,將Ta18基因克隆入CotC結(jié)構(gòu)基因的下游,構(gòu)建Pus186-CotC-Ta18重組質(zhì)粒,采用枯草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將 Pus186-CotC-Ta18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草桿菌 WB600,通過對陽性克隆的篩選,用耗竭法使CotC-Ta18融合表達(dá)在芽孢表面,每升DSM液體培養(yǎng)所生成
20、芽孢達(dá)1×1011。重組枯草芽孢表達(dá)的融合蛋白能被制備的抗血清識別。
4.2 Ta18重組枯草芽孢的生物學(xué)特性研究
4.2.1 Ta18重組枯草芽孢的抗性評估
Ta18重組枯草芽孢在模擬胃、腸環(huán)境中具有較高的耐受力和存活率,表明芽孢能耐受極端環(huán)境,能順利通過胃環(huán)境,到達(dá)腸道。
4.2.2 Ta18在亞洲帶絳蟲的組織定位及階段表達(dá)研究
免疫熒光組織定位結(jié)果顯示 Ta18定位于成蟲的表膜、蟲
21、卵的胚膜、囊尾蚴的體壁上。來自六鉤蚴的Ta18基因,在成蟲的頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)以及囊尾蚴階段均有表達(dá)。
4.2.3亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18重組枯草芽孢的免疫熒光定位及流式細(xì)胞儀檢測
以大鼠抗Ta18重組蛋白的免疫血清為一抗,熒光標(biāo)記抗大鼠(FITG標(biāo)記)為二抗Pus186-CotC-Ta18重組芽孢表面可見綠色熒光。流式細(xì)胞儀檢測到Ta18重組枯草芽孢(Pus186-CotC-Ta18)有強熒光峰。
4.3
22、Ta18重組枯草芽孢免疫保護性效果評估
4.3.1 Ta18重組枯草芽孢口服免疫家豬血清中IgG及糞便中IgA的含量變化研究
糞便中特異性IgA水平顯著高于非重組芽孢處理組及常規(guī)感染組,但血清IgG升高不明顯。
4.3.2抗Ta18多抗對亞洲帶絳蟲六鉤蚴體外作用
體外培養(yǎng)4d后,抗Ta18多抗與對照組比較,殺蟲率差異顯著(P<0.05)。
4.3.3 Ta18重組枯草芽孢口服疫苗免疫保護
23、性效果研究
4.3.3.1蟲卵攻擊感染實驗
在蟲卵攻擊后的第30、40天,可觀察到常規(guī)感染組和Pus186-CotC組家豬肝臟上囊尾蚴數(shù)量明顯多于Pus186-CotC-Ta18組,減蟲率可達(dá)到75.4%。
4.3.4感染家豬肝臟的病理學(xué)變化
囊尾蚴周圍的肝細(xì)胞可見水腫,空泡變性,組織內(nèi)較多嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤,囊尾蚴周圍組織表現(xiàn)為肉芽腫性炎。Ta18重組芽孢免疫組、CotC芽孢免
24、疫組與常規(guī)感染組囊尾蚴所致家豬肝臟病理變化未見明顯差異。
5、結(jié)論:
5.1首次根據(jù)已知的豬、牛帶絳蟲六鉤蚴18kD基因序列克隆出亞洲帶絳蟲六鉤蚴18kD基因。生物信息學(xué)預(yù)測顯示Ta18包含完整的開放閱讀框,序列長度為396bp,編碼131個氨基酸。有一信號肽序列和纖連蛋白FnⅢ型功能結(jié)構(gòu)域。
5.2對Ta18基因進(jìn)行克隆表達(dá),獲得純化蛋白。重組Ta18純化蛋白具有較強的免疫原性和免疫反應(yīng)性,可以作為潛在的
25、疫苗候選分子。但不適合作為特異的絳、囊蟲病診斷抗原。
5.3 Ta18定位于成蟲的表膜、蟲卵的胚膜和囊尾蚴的體壁上。Ta18在亞洲帶絳蟲卵、成蟲的頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)以及囊尾蚴階段均有表達(dá)。進(jìn)一步證明了 Ta18基因是疫苗候選分子。
5.4成功構(gòu)建 Pus186-CotC-Ta18重組枯草芽孢工程菌,采用枯草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將Pus186-CotC-Ta18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草桿菌WB600,免疫熒光定位及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果
26、顯示CotC-Ta18融合表達(dá)在芽孢表面。
5.5枯草芽孢在模擬胃、腸環(huán)境中具有較高的耐受力和存活率。
5.6免疫保護性效果研究顯示:1)、體外殺傷實驗證實抗Ta18血清中存在針對六鉤蚴的保護性抗體;2)、重組芽孢口服免疫家豬,糞便特異性IgA水平顯著高于對照組,血清IgG也有升高,但變化不明顯,說明重組枯草芽孢能發(fā)揮免疫佐劑作用,活化腸粘膜上的相關(guān)淋巴組織,使SIgA抗體分泌增強;3)、Ta18重組枯草芽孢的減蟲率
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