分化抑制培養(yǎng)體系支持鼠骨髓造血細胞體外擴增及造血重建的研究.pdf

1、目的:胚胎干細胞(ES)在體外通過由鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和白血病抑制因子(LIF)組成的分化抑制培養(yǎng)體系擴增的同時并維持其未分化狀態(tài)和多向分化潛能。鑒于此，本研究將MEF與LIF組成的分化抑制培養(yǎng)體系體外擴增鼠骨髓造血細胞，擬達到造血祖細胞增加，又維持造血干細胞未分化狀態(tài)和多向分化潛能的目的，避免HSC損耗、表型漂移、周期狀態(tài)改變、歸巢能力下降，以尋求一種安全有效的擴增體系。 方法:采用鼠胚胎經(jīng)胰酶消化分離培養(yǎng)MEF，用絲

2、裂霉素C滅活，成功制備鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)單層，加白血病抑制因子(LIF)成為分化抑制培養(yǎng)體系。將經(jīng)密度梯度離心法分離的鼠(雄性)骨髓單個核細胞(BMMNC)分別在分化抑制培養(yǎng)體系(MEF+LIF+IMDM)和對照組(IMDM)中培養(yǎng)7天，用流式細胞儀檢測造血干/祖細胞(Sca-1+)表型、歸巢相關粘附分子VLA-4(CD49d)、VLA-5(CD49e)、LFA-1(CD11a)、HCAM(CD44)、L-selectin(CD62L

3、)，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI法測凋亡率、流式細胞儀測定細胞周期、標準集落生成實驗檢測造血活性。 結果:(1)12～14日齡的鼠胚胎組織適宜制備鼠胚胎成纖維細胞(MEF)，3～5代MEF經(jīng)絲裂霉素C處理后宜用做飼養(yǎng)層。MEF飼養(yǎng)層加LIF后制備成分化抑制培養(yǎng)體系。(2)分化抑制培養(yǎng)體系明顯擴增了BMMNC細胞總數(shù)，擴增倍數(shù)9.78±2.1，BFU-E擴增了11.6±1.4倍，CFU-GM擴增了18.7±3.1倍，CFU-G

4、MMM擴增了21.7±2.5倍。Sca-1+細胞擴增了7.2±0.5倍，(P＜0.05)。而去掉MEF和LIF后的對照組培養(yǎng)體系BMMNC細胞總數(shù)明顯下降，CFC和Sca-1+細胞完全死亡，細胞大部分凋亡(P＜0.01)。(3)新鮮分離的BMMNC中Sca-1+細胞百分率為2.52±0.5％，分化抑制體系有效擴增Sca-1+細胞，Sca-1+細胞占MNC百分率增加，達18.15±3.46％(P0.05)，而對照組(無MEF及LIF)第7

5、天Sca-1+細胞百分率為0(P＞0.05)。(4)擴增前BMMNC細胞表面的CD49d和CD44表達水平高，分別為(91±2.8)％、(96±0.8)％，CD49e和CD11a表達居中，分別為(62±7.2)％、(72±6.1)％，而CD61L表達低，為(47±4.8)％，擴增后BMMNC細胞表面各粘附分子表達如下：CD49d、CD44和CD61L表達與擴增前相當(P＞0.05)，而CD49e和CD11a表達明顯高于擴增前(P＜0.0

6、5)。(5)MEF+LIF組BMMNC的凋亡率(AnnexinV+/PI-)為4.32±1.5％，而對照組BMMNC的凋亡率為84.56±12.4％(P＞0.05)，顯示分化抑制培養(yǎng)體系明顯抑制骨髓造血細胞的凋亡，促進細胞增殖。(6)新鮮分離的BMMNC中G0/G1期細胞占80.82％，S+G2/M期細胞占19.06％，經(jīng)分化抑制體系擴增后G0/G1細胞占80.16％，S+G2/M期細胞占20.21％，無顯著性差異(P＞0.05)。

7、 結論:MEF與LIF組成的分化抑制培養(yǎng)體系不僅可以在體外顯著擴增鼠骨髓造血細胞，顯示骨髓造血細胞總數(shù)、干/祖細胞(Sca-1+細胞)及CFC均有顯著增加，并且Sca-1+細胞百分率明顯增加，未出現(xiàn)表達下降表型漂移，提示該擴增體系有助于造血祖細胞增加，又維持造血干細胞未分化狀態(tài)和多向分化潛能，未出現(xiàn)HSC損耗、表型漂移。且擴增后的造血細胞細胞周期狀態(tài)無明顯改變，主要在G0/G1期，總體上保持其表面歸巢相關粘附分子的表達，有些粘附分子

8、表達增加，初步提示擴增后HSC歸巢功能不會減低，可能會增強，但有待體內(nèi)實驗證實。故該體系有助于造血祖細胞增加，又維持造血干細胞未分化狀態(tài)和多向分化潛能，未出現(xiàn)HSC損耗、表型漂移、周期狀態(tài)改變、歸巢能力下降，顯示分化抑制體系是一種安全、有效的擴增體系，但需進一步體內(nèi)研究證實。 目的:利用實驗動物進行體內(nèi)分析造血干/祖擴增效果是目前最可靠的HSC數(shù)目與功能的評價方法。收集本研究第一部分在體外經(jīng)分化抑制培養(yǎng)體系擴增后來自雄性供體的鼠

9、骨髓造血細胞，移植給相同遺傳背景的雌性小鼠，觀察其歸巢、造血重建情況，檢測體內(nèi)歸巢、造血重建來評價擴增效果，從而更加科學評價分化抑制培養(yǎng)體系的擴增效果。 方法:收集經(jīng)分化抑制培養(yǎng)體系體外擴增的雄性BALB/C小鼠骨髓造血細胞，雌性受者BALB/C小鼠術前5天飲用抗生素溶液腸道消毒，在武漢協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心行60Co照射(總劑量為9.0Gy,分兩次，每次4.5Gy間隔3小時)，6小時后按下列分組移植：A組(n=12)：擴增后的鼠骨髓

10、造血細胞1×106/只經(jīng)尾靜脈注射；B組(n=12)：未擴增即新鮮分離的鼠骨髓造血細胞1×106/只經(jīng)尾靜脈注射；C組(n=10)：尾靜脈注射0.3ml～0.5mlPBS/只。移植后24小時，取小鼠雙側股骨及脛骨，用PBS沖洗骨髓腔，裂解紅細胞后，制成骨髓細胞懸液，計數(shù)備用，雙側股骨及脛骨的骨髓細胞占總骨髓細胞數(shù)25％，由此計算得到總骨髓細胞數(shù)，將骨髓細胞懸液涂片，用FITC標記的鼠Y-染色體探針FISH方法檢測Y染色體陽性細胞百分率，

11、每張涂片至少計數(shù)100個細胞，歸巢率=Y染色體陽性細胞百分率×總骨髓細胞數(shù)/移植細胞數(shù)。移植后存活的小鼠第3、6、9、12、15、18、25、32、42天斷尾取血，用日產(chǎn)8000型自動血細胞計數(shù)儀測定外周血的紅細胞、白細胞、血小板。 結果:(1)9.0Gy照射后小鼠，尾靜脈注射PBS組全部死亡，平均存活時間6.4天，而注射擴增骨髓造血細胞組和未擴增即新鮮分離的骨髓造血細胞組小鼠均能長期存活。(2)移植后24小時，制備骨髓細胞懸液

12、涂片,FISH檢測Y染色體陽性雄性供者細胞百分率，F(xiàn)ITC標記Y染色體探針，在OlympusBX60熒光鏡下WB濾片下可發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)有綠色熒光的雄性供者來源的陽性細胞。經(jīng)分化抑制培養(yǎng)體系擴增的骨髓造血細胞歸巢率為15.6±1.3％，而未擴增的骨髓造血細胞歸巢率為4.6±0.3％(P＜0.05)。(3)移植后存活小鼠第3、6、9、12、15、18、32、42天經(jīng)斷尾取血，檢測外周血的白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板(PLT)，正常B

13、ALB/C小鼠血象WBC(6～9.2×103/ul)、RBC(9.6～11.4×106/ul)、PLT(10.9～13.8×105/ul)，經(jīng)分化抑制培養(yǎng)體系擴增后的骨髓造血細胞移植后9天恢復白細胞到正常水平，而未擴增的骨髓造血細胞移植后需要32天才能恢復到正常值低限,且9～32天前者白細胞水平明顯高于后者(P＜0.05)。移植擴增的骨髓造血細胞后能有效改善貧血，其紅細胞水平在12～15天明顯高于未擴增組(P＜0.05)，移植擴增骨髓造

14、血細胞后能有效恢復血小板，其血小板水平在12～32天明顯高于未擴增組.(P＜0.05)。 結論:用分化抑制培養(yǎng)體系體外擴增的鼠骨髓造血細胞，移植給致死照射的同系小鼠，其歸巢率增加，明顯加快恢復受體小鼠外周血的紅細胞、白細胞、血小板。分化抑制培養(yǎng)體系支持鼠骨髓造血細胞體外擴增、歸巢及造血重建，體外及體內(nèi)實驗顯示它是一種良好的擴增體系。初步顯示分化抑制培養(yǎng)體系有助于造血調(diào)控研究、造血干細胞移植，是一種安全有效的擴增體系，為下一步人源