HIV-1慢性感染者CD16+DC表型與功能研究.pdf

1、目的
　　 艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),是一種由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus,HIV)引起的以CD4+T細(xì)胞的漸進(jìn)性下降為特征的免疫缺陷性疾病,多因合并各種機會性感染和腫瘤而死亡。目前無法徹底治愈,且無有效的疫苗,原因之一在于宿主免疫細(xì)胞在HIV-1致病過程中發(fā)揮的作用仍未清楚,其中樹突狀細(xì)胞(Dend

2、ritic cells,DC)的研究備受關(guān)注。DC是免疫系統(tǒng)中功能最強的一種抗原提呈細(xì)胞,是連接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁,HIV-1感染中DC啟動免疫應(yīng)答和傳播病毒的“雙刃劍”作用到底是利于機體免疫還是利于病毒播散還未研究清楚。傳統(tǒng)定義的外周血DC分為2個亞群:一群為髓系來源的DC(myeloid DC,mDC);另一群為淋巴系來源的類漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoid DC,pDC),兩者均是CD16陰性的DC。最近研究發(fā)現(xiàn)D

3、C中存在一個新的亞群:CD16+DC,高表達(dá)Fc(gamma)RIII(CD16)。CD16+DC受抗原刺激后發(fā)育成熟,高表達(dá)MHC分子、共刺激分子(CD80、CD86、CD40)以及分泌TNF-α、IL-12等細(xì)胞因子,具有遞呈抗原和刺激初始T細(xì)胞活化以及誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力,在抗病毒感染和抗腫瘸免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前國外關(guān)于CD16+DC這一新亞群的研究較少,在HIV-1感染者中研究更少。國外有關(guān)HIV-1感染者CD16+

4、DC數(shù)量與功能變化的研究結(jié)果還不一致,而有關(guān)CDl6+DC的研究在國內(nèi)還未見報道。
　　 CD16+DC作為DC的一個新亞群在HIV-1感染中所發(fā)揮的作用目前尚不清楚,CD16+DC表型和功能變化可能影響其介導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生和疾病進(jìn)展的控制。本研究擬對HIV-1慢性感染者CD16+DC的數(shù)量、活化成熟狀態(tài)、細(xì)胞因子分泌能力以及具有播散病毒作用的CD205分子的表達(dá)情況進(jìn)行系統(tǒng)研究,明確HIV-1慢性感染者CD16+DC表型與功能

5、的變化,明確CD16+DC在HIV-1感染中的作用,為控制HIV-1的感染和傳播提供思路。
　　 方法
　　 1、研究對象
　　 HIV-1慢性感染者(chronic HIV-1 infection,CHI)18例,均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診,感染途徑為男男性接觸,即HIV-1+MSMs。平均年齡31(20-50)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):未接受抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療,感染時間一年以上。
　　 健康對照組(N

6、C)13例,平均年齡29(24-45)歲,入選標(biāo)準(zhǔn):血常規(guī)及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性,無免疫系統(tǒng)疾病。
　　 本研究內(nèi)容獲得參加者的書面知情同意。
　　 2、標(biāo)本采集
　　 用10毫升EDTA抗凝負(fù)壓真空采血管采集研究對象外周靜脈血,在6小時內(nèi)進(jìn)行試驗。
　　 3、密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)
　　 按照人外周血單個核細(xì)胞提取操作規(guī)程進(jìn)行實驗,準(zhǔn)備EDTA

7、-抗凝全血10ml,在離心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液14ml,沿管壁緩慢加入用PBS稀釋后的抗凝全血30ml,離心400g,30min。吸取界面層的PBMC,移入另一試管中,加入5倍體積的PBS緩沖液,洗細(xì)胞2次。得到的細(xì)胞用含有10%DMSO的胎牛血清(FBS)凍存。
　　 4、CD16+DC細(xì)胞比例、表面共刺激分子及表面受體的檢測
　　 復(fù)蘇3×106PBMC,并平均分配至5個流式細(xì)胞管中。以

8、Lin-FITC/HLA-DR-APC-CY7/CD16-PE-CY7定義CD16+DC;分別加入抗CD40、CD83、CD80、CD86、CXCR4、CCR5、CD205熒光抗體,混勻,4℃冰箱避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后,每管加入2mlPBS,離心,棄上清重懸細(xì)胞,加入1%多聚甲醛的固定,應(yīng)用LSR-II流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。
　　 5、CD16+DC細(xì)胞因子分泌的檢測
　　 將

9、復(fù)蘇好的6×106PBMC放入12孔培養(yǎng)板中,分別用TLR4激動劑LPS和TLR8激動劑R848刺激細(xì)胞,同時加入GolgiPlug,設(shè)置未刺激對照孔。充分混勻后,將12孔培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時。孵育結(jié)束后取5支流式管,將細(xì)胞和單克隆熒光抗體Lin-FITC/HLA-DR-APC-CY7/CD16-PE-CY7加入到相應(yīng)各管中,混勻,4℃冰箱避光孵育30分鐘。表面染色后,加入Cytofix/Cytoperm so

10、lution 4℃冰箱中破膜20分鐘。破膜結(jié)束后,洗滌,各管加入胞內(nèi)染料組合(TNF-α-PE/IL-6-APC、IL-12-PE/IL-10-APC)后充分混勻,4℃冰箱避光孵育30分鐘。洗滌,1%多聚甲醛固定后應(yīng)用LSRII流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,BDFACSDivaTM軟件分析結(jié)果。
　　 6、CD4+T細(xì)胞絕對計數(shù)
　　 將20μlBD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中,逆向加

11、入50μl混勻的抗凝全血,室溫避光染色15分鐘,加入1×免洗溶血素450μl,室溫避光溶血15分鐘,應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及MuitiSET軟件檢測并分析得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對值。
　　 7、HIV-1病毒載量測定
　　 取1mlEDTA抗凝血漿,采用Roche公司COBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R) TaqMan(R)System自動載量儀上以實時熒光定量PCR方法測定病毒載

12、量。全部操作按照操作說明書進(jìn)行。
　　 8、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)處理成中位數(shù)或均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,兩組間實驗指標(biāo)的比較采用Mann-Whitney U檢驗,相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、CD16+DC表型的變化研究:
　　 1、HIV-1慢性感染者外周血CD16+DC百分比與健康對照的比較及其與CD

13、4和HIV-1病毒載量(VL)的關(guān)系:
　　 HIV-1慢性感染者CD16+DC百分比高于健康對照組(P=0.048),與CD4和病毒載量無相關(guān)性(P=0.880,P=0.760)。
　　 2、HIV-1慢性感染者CD16+DC表面共刺激分子和受體與健康對照的比較:
　　 HIV-1慢性感染者CD16+DC表達(dá)CD40和CD86的百分比高于健康對照組(P=0.014,P=0.022)。CD16+DC表達(dá)CD80和

14、CD83的百分比與健康對照組相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.806,P=0.315)。
　　 HIV-1慢性感染者CD16+DC表達(dá)HIV-1輔助受體CXCR4和CCR5的百分比顯著高于健康對照組(P=0.001,P＜0.001)。
　　 HIV-1慢性感染者CD16+DC表達(dá)CD205的百分比高于健康對照組(P=0.012)。
　　 3、HIV-1慢性感染者CD16+DC表面CD205的表達(dá)與CD4和病毒載量的關(guān)系

15、:
　　 HIV-1慢性感染者CD16+DC表面CD205的表達(dá)與HIV-1病毒載量顯著正相關(guān)(r=0.602,p=0.008),與CD4無顯著相關(guān)性,有負(fù)相關(guān)趨勢(r=-0.412,p=0.089)。
　　 二、CD16+DC功能的變化研究:
　　 1、在TLR4激動劑LPS、TLR8的激動劑R848分別刺激作用下CD16+DC細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10分泌水平的變化:
　　

16、在TLR4激動劑LPS刺激作用下,HIV-1慢性感染者CD16+DC產(chǎn)生的TNF-α、IL-6低于健康對照組(P=0.018,P=0.003)。
　　 在TLR8激動劑R848的刺激作用下,HIV-1慢性感染組CD16+DC產(chǎn)生的TNF-α、IL-6、IL-12低于健康對照組(P=0.025,P=0.014,P=0.034)。
　　 在兩種刺激下,HIV-1慢性感染組CD16+DC產(chǎn)生的IL-10的較健康對照組有上升趨勢

17、,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2、TNF-α、IL-6、IL-12的分泌水平與病毒載量的相關(guān)關(guān)系:
　　 在TLR4激動劑LPS刺激作用下,HIV-1慢性感染者CD16+DC產(chǎn)生的TNF-α、IL-6與病毒載量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.717,P=0.001;r=-0.626,P=0.005),IL-12與病毒載量有負(fù)相關(guān)趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(r=0.437,P=0.07)。
　　 在TLR8激動劑R848刺激作用下

18、,HIV-1慢性感染者CD16+DC產(chǎn)生的TNF-α、IL-6與病毒載量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.756,P＜0.001;r=-0.728,P=0.001),IL-12與病毒載量有負(fù)相關(guān)趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(r=-0.442,P=0.066)。
　　 結(jié)論
　　 1、HIV-1慢性感染者外周血CD16+DC數(shù)量增加,共刺激分子CD40和CD86的表達(dá)上調(diào),提示HIV-1慢性感染者CD16+DC處于高活化狀念:細(xì)胞因子分泌功