HIF-1α和HIF-2α在小細(xì)胞肺癌腫瘤干細(xì)胞和腫瘤組織中表達(dá)的研究.pdf

1、研究目的
　　 1.研究小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞中HIFs有無表達(dá)及其意義。
　　 2.研究小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中HIFs的表達(dá)及其臨床病理意義。
　　 研究方法
　　 1.利用干細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)，富集小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446第三代腫瘤球細(xì)胞作為腫瘤干細(xì)胞。
　　 2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446腫瘤球細(xì)胞和親代細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α的mRNA表達(dá)。

2、　　 3.進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)HIF-2α調(diào)控的靶基因OCT-4及其它干細(xì)胞相關(guān)基因SOX2、c-Myc和NONOG的mRNA表達(dá)。
　　 4.采用免疫熒光染色方法，檢測(cè)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446腫瘤球細(xì)胞和親代細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α和OCT-4的蛋白表達(dá)。
　　 5.通過免疫組化染色方法，檢測(cè)45例小細(xì)胞肺癌組織中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)并分析其臨床病理意義。
　　 6.采用

3、Spearman秩相關(guān)方法，分析HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)記物uPAR的相關(guān)性。
　　 7.采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行單因素分析，再將單因素回歸分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的多因素分析。
　　 結(jié)果
　　 1.小細(xì)胞肺癌腫瘤干細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)
　　 (1)本課題組前期工作證明小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446第三代腫瘤球細(xì)胞富集腫瘤干細(xì)

4、胞，本研究以第三代腫瘤球細(xì)胞作為腫瘤干細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:與親代細(xì)胞相比，腫瘤球細(xì)胞HIF-2α的mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)，相反，HIF-1α的mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05），提示HIF-1α和HIF-2α的mRNA表達(dá)水平呈互補(bǔ)特征。
　　 (2)進(jìn)一步檢測(cè)HIF-2α的靶基因OCT-4及干細(xì)胞相關(guān)基因在腫瘤球細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示:與親代細(xì)胞相比，腫瘤球細(xì)胞OCT-4的mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P

5、＜0.05)，而SOX2、c-Myc和NONOG的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (3)免疫熒光染色結(jié)果顯示:腫瘤球細(xì)胞中，HIF-2α呈現(xiàn)陽性表達(dá)，而HIF-1α呈弱陽表達(dá)甚至陰性;相反，親代細(xì)胞中，HIF-2α呈弱陽表達(dá)甚至陰性，而HIF-1α呈陽性表達(dá)，提示HIF-1α和HIF-2α的蛋白表達(dá)也呈互補(bǔ)特征。
　　 2.小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)及其臨床意義

6、　　 (1)小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中HIF-1α的陽性表達(dá)率為48.9％(22/45)，癌旁正常組織中無HIF-1α表達(dá);HIF-1α陽性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于腫瘤細(xì)胞胞核，陽性細(xì)胞散在分布于癌巢。HIF-2α的陽性表達(dá)率為24.4％(11/45)，癌旁正常組織中無HIF-2α表達(dá);HIF-2α陽性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于腫瘤細(xì)胞胞核，陽性細(xì)胞主要分布于腫瘤壞死組織周圍區(qū)域。腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中，一小部分形態(tài)上確定為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中亦可見HIF-2α表

7、達(dá)。
　　 (2) HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)記物uPAR（前期研究結(jié)果）的Spearman相關(guān)分析顯示:HIF-1α與uPAR表達(dá)無相關(guān)性(P=0.183，r=0.202)，但HIF-2α與uPAR的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P=0.001，r=0.497)。為了進(jìn)一步弄清HIF-2α和uPAR在小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)定位是否也具相關(guān)性，我們進(jìn)行HIF-2α和uPAR的免疫組化連續(xù)切片染色，結(jié)果顯示:HIF-2

8、α與uPAR在某種程度上共同表達(dá)于小細(xì)胞肺癌組織壞死周圍區(qū)域，盡管HIF-2α陽性細(xì)胞與uPAR陽性細(xì)胞沒有完全重疊。
　　 (3) HIF-2α的表達(dá)與小細(xì)胞肺癌腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān):隨著腫瘤體積的增大，HIF-2α的表達(dá)隨之增高（P＜0.05），HIF-2α陽性組患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高于HIF-2α陰性組（P＜0.05）。但是HIF-1α的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明確統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞

9、0.05)。
　　 (4)單因素分析結(jié)果顯示小細(xì)胞肺癌患者生存時(shí)間縮短與HIF-1α、HIF-2α、年齡和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。但將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行多因素分析，結(jié)果表明只有HIF-2α和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能作為小細(xì)胞肺癌獨(dú)立預(yù)后因素。
　　 結(jié)論
　　 1.小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446腫瘤干細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α均有表達(dá)，但HIF-2α表達(dá)水平上調(diào)，HIF-1α表達(dá)水平反而下調(diào)，提示兩者的表達(dá)呈互補(bǔ)特征。<