小干擾RNA抑制乳腺癌T47D細(xì)胞端粒酶活性的研究.pdf

1、背景與目的： 端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的DNA重復(fù)結(jié)構(gòu)，由端粒DNA重復(fù)序列與端粒相關(guān)蛋白組成，具有維持染色體結(jié)構(gòu)完整性的作用。端粒酶是具有特殊逆轉(zhuǎn)錄酶活性的核糖核蛋白復(fù)合物，它的活化可以使端粒不斷復(fù)制延長(zhǎng)，從而使細(xì)胞“逃脫”衰老和凋亡獲得永生化，這是導(dǎo)致許多惡性腫瘤發(fā)生的最關(guān)鍵的條件。端粒酶在人類正常細(xì)胞(生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞除外)和組織中幾乎不表達(dá)，而在惡性腫瘤及永生化細(xì)胞中活性顯著升高，其在人類惡性腫瘤總的表達(dá)率為85％

2、左右。端粒酶由端粒RNA成分(TR)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和端粒相關(guān)蛋白1(TP1)3個(gè)亞單位組成，其中TERT是端粒酶的催化亞單位，對(duì)端粒酶活性起著重要作用，與端粒酶活性呈正相關(guān)；其他2個(gè)亞基均不能作為端粒酶的活性指標(biāo)。近年來(lái)興起的RNA干擾技術(shù)因?yàn)槟芴禺悺⒏咝У氖拱谢虺聊?，而成為基因功能研究的?qiáng)有力工具。本研究選用高表達(dá)hTERT的乳腺癌細(xì)胞T47D，利用RNAi干擾技術(shù)封閉hTERT基因的表達(dá)，檢測(cè)癌細(xì)胞的端粒酶活性變化以

3、及細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，以期為抗腫瘤治療提供新思路。 方法： 選擇hTERT基因較高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞系T47D為研究對(duì)象。siRNA表達(dá)載體選擇TaKaRa(寶生物)公司的pBAsi-hU6-Neo(BamHI/HindIII)載體。首先，從hTERT基因序列中選取4段18m的片斷，并取其中一段序列隨機(jī)打亂堿基順序作為陰性對(duì)照，設(shè)計(jì)并合成10條互補(bǔ)的DNA序列，經(jīng)退火形成雙鏈，連接質(zhì)粒載體，構(gòu)建pBAsi-hU6-Neo/

4、siRNA1、pBAsi-hU6-Neo/siRNA2、pBAsi-hU6-Neo/siRNA3、pBAsi-hU6-Neo/siRNA4和pBAsi-hU6-Neo/siRNA2negative等五種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化所得質(zhì)粒到大腸桿菌中，經(jīng)過(guò)克隆、篩選、擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，酶切并測(cè)序鑒定。然后將純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到。T47D細(xì)胞中，在hU6啟動(dòng)子作用下，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成具有3-突出的發(fā)卡RNA。G418篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，進(jìn)行克隆化，擴(kuò)大培養(yǎng)。采

5、用RT-PCR法檢測(cè)hTERT的mRNA表達(dá)；westernblot檢測(cè)hTERT蛋白的表達(dá)；TRAP-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞的端粒酶活性；選用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察細(xì)胞的增殖活性變化，并以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。 結(jié)果： 1.成功地構(gòu)建了五種能夠表達(dá)siRNA的質(zhì)粒pBAsi-hU6-Neo/siRNA，通過(guò)測(cè)序分析，證實(shí)插入載體的核苷酸序列和設(shè)計(jì)完全符合。 2.轉(zhuǎn)染純化后的質(zhì)粒到T47D細(xì)胞中，經(jīng)G4

6、18篩選出了五種轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞：T47D/siRNA1、T47D/siRNA2、T47D/siRNA3、T47D/siRNA4和T47D/siRNA2negative。 3.RT-PCR和westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示T47D/siRNA2、T47D/siRNA3和T47D/siRNA4三組細(xì)胞的hTERTmRNA和hTERT蛋白表達(dá)量較對(duì)照T47D細(xì)胞(T47Dcontrol)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；而T47D/s

7、iRNA1和T47D/siRNA2negative組細(xì)胞同T47Dcontrol細(xì)胞則無(wú)明顯差別。 4.TRAP-ELISA法檢測(cè)表明T47D/siRNA2、T47D/siRNA3和T47D/siRNA4三組細(xì)胞端粒酶活性較T47Dcontrol細(xì)胞明顯降低(P<0.05)；而T47D/siRNA1和T47D/siRNA2negative組細(xì)胞的端粒酶活性同T47Dcontrol細(xì)胞相比差別不明顯。 5.MTT繪制的生長(zhǎng)

8、曲線顯示T47D/siRNA2、T47D/siRNA3和T47D/siRNA4三組細(xì)胞生長(zhǎng)速度較T47Dcontrol細(xì)胞明顯降低；T47D/siRNA1生長(zhǎng)速度也有減緩，T47D/siRNA2negative組細(xì)胞增殖能力同T47Dcontrol細(xì)胞則無(wú)明顯差別。 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明T47D/siRNA1、T47D/siRNA2、T47D/siRNA3和T47D/siRNA4三組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增高，而S期細(xì)胞