利用擴(kuò)增片段酶切分析法檢測基因組編輯的同源重組效率.pdf

1、基因組編輯技術(shù)的快速發(fā)展，使得人們能夠按照意愿對基因組位點(diǎn)進(jìn)行編輯修飾，實(shí)現(xiàn)基因的敲入和敲除?；蚪M編輯技術(shù)能夠利用分子生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)對基因的改造，從而幫助人們深層次地理解基因的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、基因功能與生物表型之間的關(guān)系，是進(jìn)行基因功能研究、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備和基因治療的重要手段。特別是新興的CRISPR/Cas9技術(shù)，以其編輯效率高，制作簡單和成本低的特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于斑馬魚，果蠅，小鼠等模式生物和人類細(xì)胞中。該技術(shù)的快速發(fā)展必將給人類疾

2、病治療和動(dòng)植物新品種的培育帶來革新性的改變。在細(xì)胞中，基因組發(fā)生雙鏈斷裂，細(xì)胞啟動(dòng)自身同源重組修復(fù)的效率是極低的，而這種低效率的修復(fù)不能滿足人們對靶位點(diǎn)精確修復(fù)的要求。同源重組修復(fù)效率的高低跟位點(diǎn)自身以及同源重組片段的大小都有密切的關(guān)系。在之前的研究中人們發(fā)現(xiàn)：隨著同源臂的增大，位點(diǎn)的同源重組效率也是逐漸增加的。本實(shí)驗(yàn)以人293T細(xì)胞為平臺，利用CRISPR/Cas9技術(shù)造成基因雙鏈斷裂，用不同大小的同源重組片段（250 bp,500

3、bp,750 bp,1 kb,1.5 kb,2 kb）去重組修復(fù)，驗(yàn)證同源片段大小對同源重組效率的影響。結(jié)果顯示隨著同源片段不斷增大，同源重組效率也是不斷提高的，但是效率增加的幅度并不是均勻的。在一些位點(diǎn)的檢測中，我們還發(fā)現(xiàn)了同源重組效率隨著同源片段大小的增加呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢。
　　本研究建立了一種能夠用分子手段檢測同源重組效率的方法-AFDA（amplification fragment digestion analysi

4、s），相較于eLIFE上的方法—用200bp的同源片段重組修復(fù)，AFDA可以進(jìn)行任何長度的同源片段的檢測，而且我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小片段的檢測結(jié)果不具有均一性。對于不同的位點(diǎn)而言，短片段的重組效率不如長片段的重組效率更具可靠性，不能代表該位點(diǎn)的真實(shí)重組效率。在HR效率結(jié)果檢測方法上，本實(shí)驗(yàn)采用了三種不同的方法，瓊脂糖凝膠電泳檢測，聚丙烯酰胺凝膠檢測和Agilent生物芯片技術(shù)。三種方法都能采用，只是對于效率差別較小的位點(diǎn)，瓊脂糖凝膠的分辨

5、率不高。聚丙烯酰胺凝膠的分辨率可以達(dá)到要求，但是整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長。相比較之下，Agilent生物芯片有著明顯的優(yōu)勢，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成樣品分析，具有高效率，高穩(wěn)定性，高精確性等特點(diǎn)。除此之外，本實(shí)驗(yàn)還以自行構(gòu)建的Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系為平臺，通過不同類型小分子物質(zhì)的添加，驗(yàn)證小分子物質(zhì)對打靶位點(diǎn)的同源重組效率的影響。結(jié)果證實(shí)兩種類型的小分子物質(zhì)確實(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞的同源重組修復(fù)?？傊?，本實(shí)驗(yàn)提供一種檢測HR效率的方法，為高效率靶位點(diǎn)的選取提