釉基質蛋白對成纖維細胞和角質形成細胞生物學功能的影響及其對兔耳創(chuàng)面愈合影響的實驗研究.pdf

1、皮膚軟組織缺損后的創(chuàng)面修復是整形外科中經常遇到的問題。創(chuàng)面愈合過程涉及一系列細胞和細胞因子之間的相互作用，尋找能夠促進創(chuàng)面愈合的新型藥物是科研的主要目的。釉基質蛋白（EMPs）已廣泛應用于促進牙周組織再生的治療，具有肯定的療效。然而，釉基質蛋白對皮膚軟組織缺損愈合影響的研究尚少。本研究分別將釉基質蛋白作用于體外培養(yǎng)的人成纖維細胞和角質形成細胞，觀察其對這兩種傷口愈合過程中主要參與細胞的生物學性質的影響，然后將釉基質蛋白應用于兔耳創(chuàng)面模型

2、，觀察其對皮膚創(chuàng)面愈合的影響。實驗方法和結果概述如下：
　　1、釉基質蛋白對成纖維細胞生物學性質的影響
　　取包皮環(huán)切術后人包皮組織，采用組織塊法培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞。取3～6代細胞進行實驗。配置不同濃度的EMPs工作液，使EMPs終濃度分別為25、50、100和200μg/mL。
　?、偌毎じ綄嶒炛?，取細胞以106/ml濃度接種于預鋪不同濃度EMPs的96孔培養(yǎng)板，每孔加0.2ml，作為實驗組（EP1、EP2、EP

3、3、EP4組）；取0.2ml相同濃度細胞懸液加入未預鋪EMPs的板孔作為對照組。分別于細胞接種1.5、3和4.5h后洗去未黏附細胞，用MTT比色法測定黏附細胞的數(shù)量。結果顯示，各時間點EP2、EP3、EP4組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EP1組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義。
　?、诩毎鲋硨嶒炛?以不同濃度的EMPs工作液再懸細胞至終濃度為5×104/ml加入96孔培養(yǎng)板，每孔加0.2ml作為實驗組（EP1、E

4、P2、EP3、EP4組）；取0.2ml相同密度不含EMPs的細胞懸液加入96孔板作為對照組。分別于細胞接種后2、4、6、8天用MTT比色法測定細胞的數(shù)量。在第2天，各組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第4天，EP2、EP3、EP4實驗組吸光度值高于對照組(P<0.05)，EP1組與對照組差異無統(tǒng)計學意義；第6天，EP2、EP3、EP4實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EP1組與對照組差異無統(tǒng)計學意義；第8天，E

5、P2、EP3實驗組同對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EP1、EP4組與對照組差異無統(tǒng)計學意義。
　?、邰裥湍z原前mRNA合成測定實驗中，以不同濃度的EMPs工作液再懸細胞至終濃度為106/ml濃度置于6孔培養(yǎng)板，每孔加2ml，作為實驗組（EP1、EP2、EP3、EP4組）；取2ml相同密度不含EMPs的細胞懸液加入6孔板作為對照組。培養(yǎng)第5天終止培養(yǎng)，以RT-PCR法測定Ⅰ型膠原前mRNA合成量。結果顯示，EP2、EP

6、3、EP4組Ⅰ型膠原前mRNA合成量高于對照組。
　　2、釉基質蛋白對角質形成細胞生物學性質的影響
　　取包皮環(huán)切術后人包皮組織，采用消化法培養(yǎng)人角質形成細胞。取第3代細胞進行實驗。配置不同濃度的EMPs工作液，使EMPs終濃度分別為25、50、100和200μg/mL。
　?、偌毎じ叫詫嶒炛?，取細胞以6×104/ml密度接種于預鋪不同濃度EMPs的96孔培養(yǎng)板，每孔加0.2ml，作為實驗組（EP1、EP2、EP3、

7、EP4組）；取0.2ml相同密度細胞懸液加入未預鋪EMPs的板孔作為對照組。分別于細胞接種1.5、3、4.5和6h后吸去未黏附細胞，用MTT比色法測定黏附細胞數(shù)量。1.5h時，各實驗組與對照組差異無統(tǒng)計學意義；3h時，EP2組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EP1、EP3、EP4組與對照組差異無統(tǒng)計學意義；4.5h時，EP2、EP3、EP4組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EP1組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義。6h時，

8、EP3、EP4組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EP1、EP2組與對照組差別無統(tǒng)計學意義。
　　②細胞增殖實驗中,以不同濃度的EMPs工作液再懸細胞至終濃度為4×104/ml加入96孔培養(yǎng)板，每孔加0.2ml作為實驗組（EP1、EP2、EP3、EP4組）；取0.2ml相同密度不加EMPs細胞懸液加入96孔板作為對照組。分別于細胞接種后2、4、6、8天用MTT比色法測定細胞的量。各時間點各組之間差別均無統(tǒng)計學意義。

9、　?、奂毎w外劃痕實驗中，以不同濃度的EMPs工作液再懸細胞至終濃度為2×105濃度置于12孔培養(yǎng)板，每孔加2ml,作為實驗組（EP1、EP2、EP3、EP4組）；取2ml相同密度不加EMPs細胞懸液加入12孔板作為對照組。培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)液中均加入5ug/ml的絲裂霉素C以抑制細胞增殖。24小時后用體外劃痕法測定體外創(chuàng)面的愈合率。各實驗組與對照組愈合率差異無統(tǒng)計學意義。
　　3、釉基質蛋白對兔耳創(chuàng)面愈合的影響
　　選取

10、日本大耳白兔5只，每側兔耳制作直徑1cm大小創(chuàng)面4個。術后每天以1.5mg/cm2EMPs+載體涂抹左耳創(chuàng)面，設為EMPs治療組，右耳創(chuàng)面僅涂抹載體作為對照組。觀察創(chuàng)面愈合情況并于術后即時及3、6、9、12、15天照相，應用ImageJ圖像分析軟件測量未愈合創(chuàng)面面積，以下面公式計算創(chuàng)面愈合率:愈合率=(原始創(chuàng)面面積-現(xiàn)有創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積)×100％。當愈合率大于90％時判定為創(chuàng)面愈合。記錄各創(chuàng)面愈合時間。第3、6天治療組和對照組間

11、差異均無統(tǒng)計學意義，第9、12、15天治療組創(chuàng)面愈合率高于對照組(P<0.05)。治療組平均愈合時間為11.4±0.95天，對照組平均愈合時間為15.6±0.82天，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　通過本實驗研究，可以認為釉基質蛋白有促進皮膚創(chuàng)面愈合的作用。它可以促進成纖維細胞的粘附、增殖及Ⅰ型膠原前mRNA合成；對角質形成細胞則僅能促進其粘附，對其增殖、遷移則無明顯作用。由此推測，主要是成纖維細胞參與了釉基質蛋白促進