丙酮酸鈉改善代謝性酸中毒作用研究.pdf

1、代謝性酸中毒是一種常見(jiàn)的酸堿平衡紊亂，在臨床上有很高的發(fā)病率和致死率。臨床上常見(jiàn)的代謝性酸中毒有乳酸酸中毒、酮癥酸中毒、高氯性酸中毒、腎小管酸中毒及毒物（甲醇、乙烯及水楊酸類化合物等）引起的酸中毒等。代謝性酸中毒有很多危害，主要為影響心肌功能、心血管功能、誘發(fā)心律不齊、激發(fā)炎癥反應(yīng)等，嚴(yán)重可導(dǎo)致患者突然死亡。代謝性酸中毒針對(duì)病因治療無(wú)效后應(yīng)使用糾酸劑。目前，臨床上常用的糾酸劑為碳酸氫鈉溶液，其通過(guò)酸堿緩沖作用來(lái)改善代謝性酸中毒。但是，研

2、究表明輸注碳酸氫鈉溶液會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)pH降低、高碳酸血癥、鈉負(fù)荷增加等副作用，而且禁用于治療通氣功能不全的代謝性酸中毒及呼吸性酸中毒。其他糾酸劑如氨丁三醇(Tris hydroxymethyl aminomethane，THAM)可能引起呼吸抑制、低血壓、低血鉀，甚至誘發(fā)心室纖顫等副作用，禁用于伴有呼吸窘迫及兒科代謝性酸中毒的救治。目前存在的糾酸劑都有其各自應(yīng)用的局限性，所以急需研發(fā)出一種同時(shí)改善細(xì)胞內(nèi)外酸中毒的糾酸劑。
　　丙酮酸

3、鈉（Sodium Pyruvate，SP）是丙酮酸的鈉鹽，在體內(nèi)以丙酮酸根離子形式存在。丙酮酸根是內(nèi)源的能量代謝底物，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。研究表明，在失血性休克液體復(fù)蘇中，丙酮酸鈉與常用的生理鹽水、乳酸林格氏液等晶體液相比，可以提高失血性休克動(dòng)物的生存率、保護(hù)重要器官（例如心、腦、腎、肺、肝和腸）功能，并且能夠改善失血性休克引起的乳酸酸中毒。本課題組一直致力于研究丙酮酸鈉在失血性休克液體復(fù)蘇中的保護(hù)作用，同樣發(fā)現(xiàn)丙酮酸鈉具有很好的糾酸

4、效果，提示丙酮酸鈉可能具有改善代謝性酸中毒的作用。然而，丙酮酸鈉能否研發(fā)為新型糾酸藥物尚需深入研究。
　　失血性休克產(chǎn)生乳酸酸中毒的原因?yàn)槲⒀h(huán)障礙及氧供不足使細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，誘發(fā)細(xì)胞代謝紊亂，多器官功能障礙，導(dǎo)致乳酸堆積。丙酮酸鈉在恢復(fù)血流灌注和組織氧供同時(shí)，通過(guò)抗炎抗氧化作用保護(hù)器官功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝紊亂，并且其自身代謝過(guò)程中消耗氫離子。因此，丙酮酸鈉改善失血性休克引起的乳酸酸中毒的作用究竟是來(lái)自于其對(duì)酸中毒病因-失血性休克

5、的治療，還是丙酮酸鈉本身具有糾酸作用，目前尚不明確。而失血性休克復(fù)蘇模型病理生理作用復(fù)雜，不利于對(duì)其改善代謝性酸中毒作用效果的評(píng)價(jià)和機(jī)制的探討，所以需要在其他代謝性酸中毒模型中考察丙酮酸鈉的糾酸效果。
　　氯化銨誘導(dǎo)的高氯性代謝性酸中毒動(dòng)物模型，是目前評(píng)價(jià)糾酸藥物的常用動(dòng)物模型，在此模型中考察丙酮酸鈉的糾酸效果及作用機(jī)制有重要意義。因?yàn)楸徕c溶液具有很低的緩沖作用（丙酮酸pKa=2.49），且其自身代謝過(guò)程消耗氫離子，推測(cè)丙酮酸

6、鈉可能通過(guò)不斷堿化細(xì)胞內(nèi)液而堿化細(xì)胞外液來(lái)改善酸中毒。因此需要在細(xì)胞內(nèi)酸中毒模型中評(píng)價(jià)丙酮酸鈉的糾酸效果。
　　本研究擬采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，研究丙酮酸鈉對(duì)代謝性酸中毒的作用效果。首先利用氯化銨誘導(dǎo)的大鼠高氯性酸中毒模型，研究三個(gè)劑量丙酮酸鈉輸注對(duì)高氯性酸中毒的作用效果，并篩選出有效的丙酮酸鈉給藥劑量。然后采用丙酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)酸中毒模型，研究不同濃度丙酮酸鈉孵育對(duì)細(xì)胞內(nèi)酸中毒作用效果。本研究在動(dòng)物水平和細(xì)胞水平評(píng)價(jià)了丙酮酸鈉改善代

7、謝性酸中毒的作用效果，以期為臨床救治代謝性酸中毒提供候選藥物。
　　一、氯化銨誘導(dǎo)高氯性酸中毒大鼠模型的建立
　　探討丙酮酸鈉對(duì)高氯性酸中毒的作用效果，需要建立高氯性酸中毒動(dòng)物模型。Marta Nowik等在日常用水中添加0.28mol/L氯化銨（含0.5％蔗糖）飼喂3天建立大鼠高氯性酸中毒模型。本研究采用Marta Nowik法建立大鼠高氯性酸中毒，并對(duì)氯化銨的飼喂時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)分為兩組，飼喂0.28mol/L氯化銨

8、（含0.5％蔗糖）為模型組(n=10)，飼喂0.5％蔗糖為對(duì)照組(n=5)。連續(xù)飼喂5天，每天分別進(jìn)行稱重，并于0、3和5天分別進(jìn)行眼眶靜脈取血100μl，進(jìn)行pH、cHCO3-、BE、cCl-、PCO2和PO2的檢測(cè)。
　　結(jié)果表明，飼喂3天后，模型組與對(duì)照組相比，大鼠靜脈血pH、cHCO3-、BE、cCl-、PCO2和PO2無(wú)明顯變化（P＞0.05）。飼喂5天后，模型組與對(duì)照組相比，大鼠靜脈血pH、cHCO3-和BE顯著降低(

9、P＜0.01)，cCl-顯著升高(P＜0.01)，PCO2和PO2無(wú)明顯變化。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飼喂氯化銨溶液5天后，大鼠體重增加值與大鼠靜脈血pH值呈正相關(guān)，并可以擬合一元直線回歸方程。說(shuō)明飼喂大鼠氯化銨5天后，大鼠體重增加值越小，靜脈血pH值相對(duì)降低的越低，大鼠酸中毒的程度越重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在制備氯化銨誘導(dǎo)的大鼠高氯性代謝性酸中毒時(shí)，可以將大鼠體重增加量作為評(píng)價(jià)大鼠機(jī)體酸堿狀況的輔助指標(biāo)。應(yīng)用此方法建立氯化銨誘導(dǎo)的大鼠中重度高氯

10、性酸中毒模型，為丙酮酸鈉藥效學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　二、丙酮酸鈉改善大鼠高氯性酸中毒的作用效果
　　采用氯化銨法建立大鼠高氯性酸中毒模型，尾靜脈輸注不同劑量的丙酮酸鈉溶液2mmol/kg(SP1,n=8),4mmol/kg(SP2,n=8),6mmol/kg(SP3,n=8)。輸注2mmol/kg碳酸氫鈉溶液為陽(yáng)性對(duì)照組(SB，n=8)，輸注2ml/kg生理鹽水為體積對(duì)照組(NS，n=8)。于輸注后15min(T15)、3

11、0min(T30)、60min(T60)、120min(T120)、240min(T240)各時(shí)間點(diǎn)眼眶靜脈取血100μl，檢測(cè)pH、cHCO3-、BE、PCO2、PO2、電解質(zhì)、血糖和血紅蛋白濃度的變化。輸注240min后，收集大鼠靜脈血進(jìn)行血肌酐、血尿素氮檢測(cè)。將大鼠處死，取腎組織并進(jìn)行HE染色，分析其病理變化。
　　結(jié)果表明，輸注丙酮酸鈉后，靜脈血pH均有所升高。其中，SP1組與NS組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SP2組和SP3組比N

12、S組高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。SB組與NS組相比，靜脈血pH顯著升高(P＜0.05)。輸注SP后，大鼠靜脈血T15時(shí)pH值比T0時(shí)高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。輸注SB后，大鼠靜脈血T30時(shí)pH值比T0時(shí)高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。SP1和SP2組在T15后，pH、cHCO3-和BE值有先降低后升高的趨勢(shì)。SP3組提高pH效果維持至240min。SB組在T30后，pH、cHCO3-和BE值有降低的趨勢(shì)，未見(jiàn)升高。丙

13、酮酸鈉和碳酸氫鈉輸注均可以降低由酸中毒引起的高血鈣(P＜0.05)。丙酮酸鈉和碳酸氫鈉輸注降低血液鉀離子濃度(P＜0.05)。輸注丙酮酸鈉后，大鼠靜脈血糖SP3組比SP1組高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。輸注240min后，各組血漿中肌酐和尿素氮水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腎病理切片顯示丙酮酸鈉不會(huì)加重由高氯性酸中毒引起的腎損傷。
　　三、丙酮酸鈉改善細(xì)胞內(nèi)酸中毒的作用研究
　　探討丙酮酸鈉對(duì)細(xì)胞內(nèi)酸中毒作用效果，需要建立檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)

14、pH(intracellular pH，pHi)的方法。本實(shí)驗(yàn)采用BCECF-AM熒光法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞pHi變化。優(yōu)化了激光共聚焦顯微鏡的參數(shù)設(shè)置，確定采用雙激發(fā)光法(激發(fā)光波長(zhǎng)分別為488nm和440nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為535nm)對(duì)細(xì)胞內(nèi)BCECF熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)計(jì)算熒光比值R(R=F(Ex=488nm/Em=535nm)/F(Ex=440nm/Em=535nm)）的大小反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)pH的變化情況。
　　本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度

15、丙酸鈉(20mmol/L和30mmol/L)對(duì)EA.hy926細(xì)胞pHi的影響，篩選丙酸鈉誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞內(nèi)酸中毒模型的最適濃度。結(jié)果表明，20mmol/L丙酸鈉組與對(duì)照組相比，加載2min和3.5min后R值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。30mmol/L丙酸鈉組與對(duì)照組相比，加載2min和3.5min后R值顯著下降(P＜0.05)。說(shuō)明30mmol/L組比20mmol/L組誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酸中毒模型穩(wěn)定。采用30mmol/L丙酸鈉溶液誘導(dǎo)EA.hy

16、926酸中毒細(xì)胞模型，通過(guò)不同濃度的丙酮酸鈉溶液共孵育，研究其對(duì)酸中毒細(xì)胞pHi作用效果。丙酮酸鈉孵育濃度分別為33mmol/L(SP1)、66 mmol/L(SP2)和100 mmol/L(SP3)。生理鹽水(NS)為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，生理鹽水組對(duì)EA.hy926酸中毒細(xì)胞pHi無(wú)影響。丙酮酸鈉三個(gè)劑量組均能夠引起EA.hy926酸中毒細(xì)胞pHi升高。與NS組相比，SP組峰值處的細(xì)胞pHi顯著升高(P＜0.05)。
　　綜上所