靶向DC-SIGN的抗原特異性免疫應(yīng)答研究.pdf

1、盡管疫苗的出現(xiàn)已經(jīng)有效的改善了人類的健康進(jìn)程，但對(duì)疫苗的設(shè)計(jì)仍有諸多改善的必要，尤其在各種新的感染性疾病層出不窮，癌癥死亡率仍步步攀升的今天。因此，采取新的策略來改善疫苗的免疫原性，設(shè)計(jì)更為有效的治療性疫苗是當(dāng)前刻不容緩的問題。 樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)是目前已知的功能最強(qiáng)大的職業(yè)抗原呈遞細(xì)胞(profesionalantigenpresentingcells，pAPCs)，能以受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、巨吞飲和

2、吞噬等方式高效的攝取外界抗原并以多種機(jī)制來呈遞抗原；作為一個(gè)自然的免疫佐劑，在遭遇危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)能高表達(dá)CD80、CD83、CD86等共刺激分子，與MHC抗原肽復(fù)合物共同作用可有效的活化效應(yīng)T細(xì)胞，并且是唯一能活化na(i)veT細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞；在靜息狀態(tài)(steadystate)的DCs細(xì)胞仍然可以有效的“抽樣調(diào)查(sample)”外界抗原，并組成性的呈遞(constitutivepresentation)這些無害的外來抗原和自身抗原

3、(30-80％為自身合成缺陷的蛋白)，通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化來誘導(dǎo)和維持外周耐受；DCs細(xì)胞兼具兩種看似矛盾的功能，正是通過它對(duì)“自身”和“非自身”抗原的判斷來決定免疫系統(tǒng)的不同反應(yīng)，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候產(chǎn)生適當(dāng)?shù)膽?yīng)答或是耐受，從而維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)；因此，利用DCs細(xì)胞來調(diào)控和改善治療性疫苗的免疫效應(yīng)，上調(diào)或是下調(diào)特定的免疫反應(yīng)，一貫是治療性疫苗設(shè)計(jì)的重要方向。 DCs細(xì)胞雖然具有強(qiáng)大的攝取抗原的功能，但它對(duì)抗原非特異的攝取和呈遞的方

4、式會(huì)造成疫苗不能被有效呈遞，從而影響疫苗的后續(xù)效應(yīng)。將抗原靶向DCs，利用DCs來改善疫苗的免疫原性是重要的疫苗設(shè)計(jì)策略。隨著分子免疫學(xué)和DC細(xì)胞生物學(xué)的進(jìn)展，許多在DC特異表達(dá)的分子被鑒定，尋找適當(dāng)?shù)陌邢蛲緩匠蔀橐粋€(gè)歷久彌新的重要課題。 新近發(fā)現(xiàn)的一些DC限制性表達(dá)的凝集素受體成為目前關(guān)注的靶向新途徑，例如DEC205和DC-SIGN。DC-SIGN(DC-specificintracellularadhesionmolecu

5、le-grabbingnonintegrin)受體是2002年發(fā)現(xiàn)的限制性表達(dá)于DC和某些組織巨噬細(xì)胞上的凝集素樣受體，DC-SIGN已經(jīng)被證實(shí)不僅是病原體受體，而且是重要的抗原受體，可有效的攝取處于粘膜組織的微量的HIV和CMV病毒顆粒，繼之可以MHC-Ⅰ類分子和MHC-Ⅱ類分子限制性方式將抗原高效呈遞出來，用人源化的鼠抗靶向DC-SIGN可以有效誘導(dǎo)na(i)veT細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。綜上，DC-SIGN的發(fā)現(xiàn)為靶向DC的疫

6、苗設(shè)計(jì)提供了新的思路。 本研究采用DC-SIGN的高親和力自然配體le(x)糖分子作為導(dǎo)向分子，利用生物素-鏈霉親和素交聯(lián)系統(tǒng)將糖分子與卵白抗原(ovalbumin,OVA)連接，由此制備了靶向DC-SIGN的抗原，然后觀察了靶向抗原負(fù)載DC之后的對(duì)免疫應(yīng)答能力的影響以及對(duì)DC本身功能狀態(tài)的影響。 首先，利用Sulfo-SMCC異源雙功能交聯(lián)試劑交聯(lián)鏈霉親和素(streptavidin，SA)和模式抗原卵白蛋白，通過SD

7、S-PAGE蛋白質(zhì)電泳和Western免疫印跡方法證實(shí)SA與OVA蛋白成功交聯(lián)，對(duì)電泳膠片的灰度掃描可估計(jì)，SA蛋白與OVA蛋白交聯(lián)的分子摩爾比約為2/1；然后，ELISA方法證實(shí)SA-OVA復(fù)合物中的SA仍具有與生物素反應(yīng)的功能，根據(jù)SA-OVA復(fù)合物與生物素修飾的Le(x)寡糖飽和反應(yīng)的比例(4.25μg：1μg)，獲得所需要的靶向抗原Le(x)-OVA復(fù)合物，1μgLe(x)糖分子飽和反應(yīng)的SA-OVA復(fù)合物中含有約1.5μgOV

8、A蛋白。由此獲得由Le(x)寡糖介導(dǎo)的靶向抗原le(x)-OVA復(fù)合物。 其次，在得到靶向DC-SIGN的抗原之后，觀察了靶向抗原是否能被DC-SIGN分子有效的攝取和內(nèi)吞，通過熒光示蹤的方法，le(x)-OVA靶向抗原在15分鐘內(nèi)被有效的攝取到表達(dá)DC-SIGN-EGFP綠色熒光融合蛋白的K562細(xì)胞中，染色OVA的紅色熒光與綠色熒光有良好的共聚現(xiàn)象產(chǎn)生，抗DC-SIGN的mAb可以有效阻斷K562-DC-SIGN-EGFP對(duì)

9、le(x)-OVA的攝取，單核細(xì)胞來源的DCs也可在15分鐘內(nèi)高效內(nèi)吞靶向抗原，但阻斷mAb不能完全阻斷原代DCs對(duì)le(x)-OVA的攝取，這可能與DCs對(duì)外界抗原強(qiáng)大的攝取能力有關(guān)，另外，用于檢測(cè)DCs對(duì)le(x)-OVA攝取時(shí)抗原劑量不合適可能也是其中原因。 然后，通過ELIspot檢測(cè)，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步比較了靶向DC-SIGN的抗原和非靶向抗原在誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答能力上的差異，研究發(fā)現(xiàn)，

10、靶向DC-SIGN的抗原明顯增強(qiáng)了包括CD8+T細(xì)胞的抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，甚至在劑量低于非靶向抗原1000倍的情況下也能誘導(dǎo)相同水平的IFN-γ+細(xì)胞產(chǎn)生，CD40L能有效促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的活化?？笵C-SIGN的阻斷mAb幾乎完全抑制了靶向DC-SIGN的抗原對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的活化，這說明DC-SIGN介導(dǎo)的抗原攝取途徑對(duì)抗原的呈遞以及繼之的效應(yīng)T細(xì)胞活化至關(guān)重要，DC-SIGN介導(dǎo)的攝取途徑能促進(jìn)外來抗原進(jìn)入高效的抗原呈遞通路

11、，使微量的抗原也能有效呈遞，從而促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞包括CD8+T細(xì)胞的活化。 隨著DC細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展和免疫調(diào)控機(jī)制研究的深入，DC細(xì)胞在調(diào)控免疫應(yīng)答和維持免疫耐受方面的貢獻(xiàn)進(jìn)一步為人們所重視。有理論指出，如果將抗原靶向處于平穩(wěn)狀態(tài)的DC細(xì)胞抗原捕獲受體，會(huì)導(dǎo)致抗原被組成性呈遞，并誘導(dǎo)抗原特異反應(yīng)T細(xì)胞的缺失和該抗原的重新刺激特異性的無反應(yīng)性，即使在有強(qiáng)效佐劑的情況下。DC-SIGN受體不僅屬于抗原捕獲受體，更由于可與表達(dá)于靜

12、息T細(xì)胞上的ICAM-3發(fā)生粘附作用，因此被高度懷疑與免疫耐受有關(guān)。近來有文獻(xiàn)報(bào)道DC-SIGN與某些自然配體相互作用可導(dǎo)致DC細(xì)胞成熟抑制，抑制性細(xì)胞因子IL-10分泌增加和Th1型極化抑制，例如來自于結(jié)核分支桿菌的ManLAM和幽門螺桿菌的含le(x)糖的脂多糖。 這些研究促使我們調(diào)查：在本研究中用于介導(dǎo)抗原靶向DC-SIGN的Le(x)寡糖是否也會(huì)在與DC-SIGN發(fā)生相互作用的同時(shí)介導(dǎo)某些免疫抑制信號(hào)的下傳? 我

13、們檢測(cè)了不同組合刺激劑作用后的DC細(xì)胞上清，在靶向抗原le(x)-OVA單獨(dú)作用和與CD40L協(xié)同作用的DC細(xì)胞上清中，沒有觀察到IL-10的分泌增加；但在le(x)-OVA與1-100ng/ml的LPS協(xié)同作用的DC細(xì)胞上清中，觀察到有明顯增強(qiáng)的IL-10的分泌，不含le(x)寡糖的OVA和SA-OVA沒有觀察到同樣效應(yīng)，這說明le(x)-OVA中的le(x)寡糖有促進(jìn)LPS誘導(dǎo)IL-10分泌的作用；同樣的體系中IL-6也呈現(xiàn)輕度的增

14、加。IFN-γ的分泌沒有明顯變化。另外，作為DC細(xì)胞成熟標(biāo)志之一的CD86分子，不僅在le(x)糖分子單獨(dú)作用時(shí)沒有明顯的抑制表現(xiàn)，在與LPS同時(shí)作用的時(shí)候，仍然沒有明顯的表達(dá)抑制的現(xiàn)象；DC-SIGN的阻斷抗體不能阻斷l(xiāng)e(x)寡糖分子聚合體與LPS協(xié)同作用下對(duì)IL-10分泌的促進(jìn)作用，它事實(shí)上模擬了DC-SIGN配體與DC-SIGN的作用，促進(jìn)了LPS對(duì)IL-10的誘導(dǎo)分泌作用。這說明，le(x)糖分子與DC-SIGN的相互作用并不

15、類似于DC-SIGN與ManLAM之間的相互作用，不會(huì)介導(dǎo)DC細(xì)胞的成熟抑制和IL-10的分泌。但是，le(x)寡糖單體卻并沒有出現(xiàn)在le(x)-OVA中含有的le(x)寡糖聚合體類似的作用，在與LPS的協(xié)同刺激下，并沒有表現(xiàn)出促進(jìn)LPS誘導(dǎo)IL-10分泌的作用。DC-SIGN與同樣寡糖分子不同組合形式的不同相互作用以及與不同佐劑之間的不同的協(xié)同作用暗示了一種免疫調(diào)控形式的存在，在適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┳饔孟拢鏑D40L，DC-SIGN受體

16、與配體之間的作用能量也許是下游免疫應(yīng)答發(fā)生與否至關(guān)重要的決定因素。 本研究結(jié)果表明：將抗原靶向DC-SIGN受體導(dǎo)致1，000倍更有效的抗原特異性T細(xì)胞的反應(yīng)，尤其是CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)；在合適的免疫佐劑作用下，DC-SIGN與le(x)糖分子聚合體之間的相互作用不會(huì)導(dǎo)致DC細(xì)胞的成熟抑制及免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10的分泌增加；利用le(x)糖分子聚合體來介導(dǎo)抗原靶向DC-SIGN受體是一個(gè)有效的促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)