豬常見(jiàn)病毒病診斷基因芯片的構(gòu)建與初步應(yīng)用.pdf

1、混合感染已經(jīng)成為豬群發(fā)病的普遍現(xiàn)象，使病情更為復(fù)雜，增加了臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷難度，因此有必要建立一種一次多元的檢測(cè)方法?；蛐酒诓≡w檢測(cè)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它以高通量并行檢測(cè)的方式，可以使病料中的多種病原體同時(shí)被檢出，具有快速、高效、靈敏的特點(diǎn)，尤其適宜于大規(guī)模的樣本檢測(cè)。 本研究采用基因芯片技術(shù)，借助多重PCR和核酸標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建了豬病毒性呼吸道病診斷基因芯片和豬病毒性繁殖障礙病診斷基因芯片，用于混合感染病料的檢測(cè)，具有同步

2、檢測(cè)和鑒別診斷的功能。主要研究?jī)?nèi)容如下： 試驗(yàn)一探針的克隆與鑒定根據(jù)Genbank收錄的PRRSV、CSFV、PCV-2、PPV、PRV、JEV和A型流感病毒核酸序列，針對(duì)不同病毒的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增病毒DNA或cDNA，得到了7種病毒的特征性核酸片段，純化后與載體pMD18-TSimpleVector連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。PCR和測(cè)序鑒定結(jié)果證明，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。多序列同源性比較結(jié)果顯示，探針序列與相關(guān)病

3、毒分離株的同源性為89～100％。重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建為基因芯片探針的制備提供了可靠、穩(wěn)定的材料來(lái)源，保證了芯片檢測(cè)的特異性。試驗(yàn)二豬病毒性呼吸道病診斷基因芯片的構(gòu)建和初步應(yīng)用 以試驗(yàn)一構(gòu)建的重組質(zhì)粒制備PRRSV、PRV、PCV-2和SIV探針，制備豬病毒性呼吸道病診斷基因芯片。 Biotin-11-dUTP使用濃度的選擇：在PCR擴(kuò)增過(guò)程用Biotin-11-dUTP替代部分dTTP對(duì)靶片段進(jìn)行標(biāo)記，擴(kuò)增體系中Biot

4、in-11-dUTP的終濃度分別為40μM、50μM、70μ-M和100μM。檢測(cè)結(jié)果顯示，4個(gè)濃度體系的產(chǎn)物都可以得到雜交信號(hào)，而且雜交信號(hào)隨著濃度的遞增而增強(qiáng)。70μM(替代35％的dTTP)的終濃度可以滿足檢測(cè)分析的要求。雜交溫度的選擇：S、PRRSV、PRV、PCV-2、SIV的靶片段分別在37℃、42℃、50℃和55℃四種不同的雜交溫度條件下與芯片雜交。檢測(cè)結(jié)果表明，各探針和陽(yáng)性對(duì)照位點(diǎn)在不同溫度條件下都有雜交信號(hào)，但多數(shù)在4

5、2℃條件下獲得較高的SNR值。各靶片段在不同溫度條件下與其它探針之間無(wú)交叉雜交信號(hào)。 雜交時(shí)間的選擇：在40min、1h、1.5h和2.0h不同雜交時(shí)間內(nèi)，各靶片段與芯片的雜交結(jié)果顯示，隨著雜交時(shí)間的延長(zhǎng)雜交信號(hào)有增強(qiáng)的趨勢(shì)。雜交時(shí)間為1h時(shí)，各探針位點(diǎn)可得到明顯的雜交信號(hào)。雜交時(shí)間太短，雜交信號(hào)弱；而時(shí)間太長(zhǎng)，由于緩沖液的揮發(fā)易造成較高的本底。 探針濃度的選擇：不同探針濃度芯片的雜交檢測(cè)結(jié)果表明，隨著探針濃度的提高，雜

6、交信號(hào)逐漸增強(qiáng)。隨后由于受到空間占位的影響，雜交信號(hào)增強(qiáng)緩慢。當(dāng)探針濃度為100ng/μl時(shí)，各相應(yīng)位點(diǎn)出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，可以滿足檢測(cè)分析的要求。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇芯片探針的點(diǎn)樣濃度為100ng/μl，PCR擴(kuò)增體系中Biotin-11-dUTP的終濃度為70μM，雜交在42℃條件下進(jìn)行，雜交時(shí)間為1h。 芯片特異性檢驗(yàn)：分別提取PRRSV、PRV、PCV-2、SIV、CSFV、PPV和大腸桿菌O1、O2核酸，用混合引物進(jìn)

7、行PCR或RT-PCR擴(kuò)增標(biāo)記后分別與芯片雜交。檢測(cè)結(jié)果表明，PRRSV、PRV、PCV-2、SIV在各自相應(yīng)的探針位點(diǎn)和陽(yáng)性對(duì)照位點(diǎn)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)；而CSFV、PPV和大腸桿菌O1、O2只有陽(yáng)性對(duì)照位點(diǎn)呈陽(yáng)性，無(wú)非特異性雜交信號(hào)。說(shuō)明所制備的芯片具有良好的特異性。 芯片靈敏性檢驗(yàn)：雜交液中靶片段的濃度范圍為12.5-250pg/μl的濃度。雜交檢測(cè)結(jié)果表明，雜交液中靶片段的濃度在62.5-250pg/μl范圍內(nèi)，各位點(diǎn)都可以得到

8、明顯的雜交信號(hào)。PCV-2探針可以檢測(cè)到雜交液中靶片段的最低濃度為12.5pg/μl，PRRSV、PRV和SIV探針可以檢測(cè)到的最低濃度為25pg/μl。 芯片重復(fù)性檢驗(yàn)：用相同濃度的靶片段，在同一雜交條件下進(jìn)行批次內(nèi)和批次間的芯片重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備的芯片具有較好的可重復(fù)性。 臨床應(yīng)用：通過(guò)對(duì)60份臨床表現(xiàn)呼吸道癥狀病例肺組織的檢測(cè)結(jié)果顯示，與PCR比較芯片檢測(cè)方法有較高的靈敏度。共檢出病毒陽(yáng)性病料41份，

9、其中60.1％(25/41)為兩種或兩種以上病毒混合感染病料。說(shuō)明病毒的混合感染是引起豬呼吸道疾病的主要原因之一。 試驗(yàn)三豬病毒性繁殖障礙病診斷基因芯片的構(gòu)建和初步應(yīng)用通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增獲得PPV、PRRSV、PRV、CSFV、JEV和PCV-2的探針，以100ng/μl探針濃度點(diǎn)樣制備豬病毒性繁殖障礙病基因芯片。以試驗(yàn)二的雜交條件進(jìn)行芯片的性能測(cè)定。 芯片特異性檢驗(yàn)：分別提取PPV、PRRSV、PRV、CSFV

10、、JEV、PCV-2和SIV、大腸桿菌O1、O2核酸，用混合引物進(jìn)行PCR或RT-PCR擴(kuò)增標(biāo)記后分別與芯片雜交。檢測(cè)結(jié)果表明，PPV、PRRSV、PRV、CSFV、JEV、PCV-2在各自相應(yīng)的探針位點(diǎn)和陽(yáng)性對(duì)照位點(diǎn)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)；而SIV、大腸桿菌O1、O2只有陽(yáng)性對(duì)照位點(diǎn)呈陽(yáng)性，無(wú)非特異性雜交信號(hào)。說(shuō)明所制備的芯片具有病毒特異性。 芯片靈敏性檢驗(yàn)：，雜交液中靶片段的濃度范圍為12.5-250pg/μl。雜交檢測(cè)結(jié)果表明，在6

11、2.5-250pg/μl的濃度范圍內(nèi)，各位點(diǎn)都可以得到明顯的雜交信號(hào)，隨著靶片段濃度的升高，雜交信號(hào)增強(qiáng)。其中PPV、PCV-2和CSFV探針可以檢測(cè)到雜交液中靶片段的最低濃度為12.5pg/μl，PRRSV、PRV和JEV探針可以檢測(cè)到的最低濃度為25pg/μl。 芯片重復(fù)性檢驗(yàn)：用相同濃度的靶片段，在同一雜交條件下進(jìn)行批次內(nèi)和批次間的芯片重復(fù)性試驗(yàn)。雜交檢測(cè)結(jié)果表明，豬繁殖障礙病診斷基因芯片具有較好的可重復(fù)性。 初步